Nós descrevemos um protocolo para a utilização de proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou Matrigel para selectivamente induzir o crescimento dendrítica em primárias neurónios simpáticos dissociadas do gânglio cervical superior (SCG) de ratos neonatais.
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Artigo de método
Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A forma do mandril dendrítica determina a entrada total sináptica um neurónio pode receber 1-3, e influencia os tipos e distribuição destes 4-6 entradas. Padrões alterados de crescimento dendrítica e plasticidade estão associados com a função neurocomportamental prejudicada em modelos experimentais 7, e são pensados para contribuir para os sintomas clínicos observados em ambas as 8-10 neurodesenvolvimento distúrbios e doenças neurodegenerativas 11-13. Tais observações ressaltam a importância funcional da regulação precisamente morfologia dendrítica, e sugerem que a identificação de mecanismos que controlam o crescimento dendrítico não só avançar na compreensão de como a conectividade neuronal é regulado durante o desenvolvimento normal, mas também pode fornecer informações sobre novas estratégias terapêuticas para diversas doenças neurológicas.
Estudos sobre os mecanismos de crescimento dendrítico seria grandemente facilitada pela disponibilidade ofa sistema modelo que permite que os neurónios a ser experimentalmente comutada a partir de um estado em que não se estendem para uma dendritos em que elaborar um mandril dendrítica comparável à do seu em homólogos in vivo. Culturas primárias de neurônios simpáticos dissociados do gânglio cervical superior (GCS) de roedores perinatais fornecer tal modelo. Quando cultivados em meio definido na ausência de soro e ganglionar células gliais, neurónios simpáticos estender um único processo que é axonal, e este estado unipolar persiste durante semanas a meses em cultura 14,15. No entanto, a adição de qualquer proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou 16,17 Matrigel 18 ao meio de cultura desencadeia estes neurónios para estender vários processos que satisfaçam os critérios morfológicos e bioquímicos e funcional para dendrites. Neurônios simpáticos dissociadas do SCG de roedores perinatais e cultivadas sob condições definidas são uma população homogênea de neurônios 19que respondem de forma uniforme para a actividade promotora de dendrite-Matrigel, BMP-7 e BMPs outros do decapentaplegic (DPP) e subfamílias 60A 17,18,20,21. Importante, Matrigel e BMP-induzida dendrite formação ocorre na ausência de alterações na sobrevivência das células ou do crescimento axonal 17,18.
Aqui, nós descrevemos como configurar culturas dissociadas de neurónios simpáticos SCG derivados da de ratos perinatais de modo que eles são responsivos à actividade dendrite-promoção selectiva de Matrigel ou BMPs.
Protocolo
1. Preparação de meio de cultura (meio de C2)
- Adicionar o seguinte, na ordem listada, para um estéril, 500 ml descartável Erlenmeyer:
Quantidade Componente Concentração Final 190 ml DMEM (glicose baixa) N / A 10 ml de ácido gordo livre de BSA (20mg/ml em DMEM) 50 ug / ml 2,8 ml L-Glutamina 1,4 mM 4 ml insulina / transferrina / selénio (100x) 10 ug / ml de insulina 5,5 ug / ml de transferrina 38,7 nM ....
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Discussão
As vantagens deste modelo incluem: (a) as culturas são compostos de uma população homogénea de neurónios simpáticos desprovidas de outros tipos de células 17,23; (b) os requisitos do factor de crescimento de neurónios simpáticos estão bem estabelecidos, o que permite o uso de meio definido, e uma variedade de meios definidos, e substratos funcionar bem para crescimento e manutenção de neurónios simpáticos 23, (c) neurónios nestas culturas responder uniformemente para a actividade promotora de dendr.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi suportado pelo financiamento do National Institutes of Health (R21 NS45037 subsídios e R01 ES014901).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Lamínulas | Bélico | 1943-10012 | 12 Coverslip Rodada mm # Espessura 1, vidro alemão |
| Bent ponta pipetas | Bélico | 1273-50003 | |
| Poli-D-lisina | Sigma | P0899-100mg | Banco de solução a 1 mg / ml |
| Água destilada | Gibco | 15230 | |
| Multa fórceps Dumont n. 4 e 5 | Belas Ferramentas Ciência (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| Calibre 20 agulhas | Becton Dickinson | 305176 | |
| L-15 de Leibovitz médio | Invitrogen | 11415 | |
| Colagenase | Worthington | 4176 | 1 mg / ml |
| Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg / ml |
| Solução salina equilibrada de Hank (-Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM baixa glicose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamina | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulina / Transferrina / Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| De ácidos gordos livre de BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Bioproducts Harlan | 5017 | |
| Ham meio nutriente F-12 (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Citosina arabinósido | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Evite a repetição de ciclos de congelamento e descongelamento |
| BMP-7 | R & D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07h | BMPs 4, 5 e 6 funcionam igualmente bem como BMP-7 e por vezes são mais fáceis de obter comercialmente |
| Paraformaldeído | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Pescador | BP151-500 | |
| Rato anti-rato MAP2 anticorpo | Sternberg monoclonais Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 cabra anti-rato | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Meios de montagem | Prolongar Sondas kit Antifade Molecular | P7481 |
Referências
- Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252....
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Reimpressões e permissões
