Artigo de método

Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

DOI:

10.3791/3560

2 de dezembro de 2011

Neste artigo

Resumo

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Um método de usar solid-state nanoporos para monitorar a adsorção não-específica de proteínas em uma superfície inorgânica é descrita. O método emprega o princípio de pulso-resistivo, permitindo a adsorção a ser sondado em tempo real e ao nível de moléculas individuais. Porque o processo de adsorção de proteínas é única longe do equilíbrio, propomos o emprego de matrizes paralelas de nanoporos sintéticos, permitindo que para a determinação quantitativa da taxa de reação aparente de primeira ordem constante de adsorção de proteínas, assim como o de adsorção de Langmuir e constante.

Resumo

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Solid-state nanoporos têm sido utilizados para realizar as medições ao nível única molécula para examinar a estrutura local e flexibilidade de ácidos nucléicos 1-6, o desdobramento de proteínas 7 e afinidade de ligação de ligantes diferentes 8. Ao unir esses nanoporos à técnica de pulso-resistivo 9-12, tais medições pode ser feito sob uma ampla variedade de condições e sem a necessidade de rotulagem 3. Na técnica de resistência de pulso, uma solução de sal iônico é introduzido em ambos os lados do nanopore. Portanto, os íons são levados de um lado da câmara para o outro por um potencial transmembrana aplicada, resultando em uma corrente constante. O particionamento de um analito na nanopore provoca uma deflexão bem definidas nesta corrente, que pode ser analisado para extrair informação única molécula. Usando esta técnica, a adsorção de proteínas único para as paredes nanopore pode ser monitorado em uma ampla gama decondições 13. Adsorção de proteínas está crescendo em importância, porque, como dispositivos microfluídicos encolher de tamanho, a interação destes sistemas com proteínas simples se torna uma preocupação. Este protocolo descreve um ensaio rápido para a proteína de ligação aos filmes de nitreto, que pode ser facilmente alargada a outros filmes finos passíveis de perfuração nanopore, ou em superfícies de nitreto de funcionalizados. A variedade de proteínas pode ser explorado sob uma ampla gama de soluções e condições de desnaturação. Além disso, este protocolo pode ser usado para explorar mais problemas básicos usando espectroscopia nanopore.

Protocolo

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1. Fabricação de estado sólido nanoporos em membranas de nitreto de silício

  1. Traga TEM FEI Tecnai F20 S / a uma tensão de aceleração de 200 kV. Se estiver usando um S diferentes / TEM, a tensão de aceleração deve ser maior ou igual a 200 kV 9
  2. Carga de 20 nm de espessura de silício SPI grade janela nitreto no porta-amostras TEM e limpo, com plasma de oxigênio por 30 segundos para remover quaisquer contaminantes do titular.
  3. Carregar a amostra para o S / TEM e permitir a vácuo para bombear para baixo. Uma vez que o S / TEM tem bombeado para baixo a vácuo, encontrar a janela de nitreto em bright-campo de modo TEM procurando por um....

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Discussão

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Adsorção espontânea de proteínas em estado sólido superfícies 27-29 é de fundamental importância em várias áreas, tais como aplicações biochip e design de uma nova classe de biomateriais híbridos funcionais. Estudos anteriores mostraram que as proteínas adsorvidas para solid-state superfícies não apresentam mobilidade lateral ou taxas de dessorção significativa e, portanto, adsorção de proteínas é geralmente considerado um processo irreversível e inespecífico 30-32. Adsorção de proteínas sobre supe.......

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Divulgações

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Não temos nada a revelar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer a John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia em Vancouver) e Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) para os seus conselhos. Este trabalho é financiado em parte por concessões do National Science Foundation EUA (DMR-0706517 e DMR-1006332) e pelo National Institutes of Health (R01-GM088403). A perfuração nanopore foi realizada no Centro de Microscopia Eletrônica do Centro Cornell de Pesquisa de Materiais (CCMR) com o apoio da National Science Foundation - Ciência dos Materiais de Pesquisa e Centros de Engenharia de programa (MRSEC) (DMR 0.520.404). A preparação das membranas de nitreto....

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Materiais

Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
Tecnai F20 S / TEM FEI S / TEM requer tensão de aceleração ≥ fonte de 200KV e de emissão de campo.
20 nm de espessura de silício janela membrana de nitreto de TEM SPI 4163SN-BA
Axon Axopatch 200B amplificador de patch-clamp Dispositivos moleculares
Axon Digidata 1440A Dispositivos moleculares
pCLAMP 10 software Dispositivos moleculares Eletrofisiologia Dados Software Aquisição e Análise
Ácido sulfúrico FIsher Scientific A300
peróxido de hidrogênio Fisher Scientific H325
silicone O-rings McMaster-Carr 003 S70 Alternativamente use PDMS
fio de prata Sigma-Aldrich 348759 Para os eletrodos
SPC Technology, D sub contato, pino Newark 9K4978 Para os eletrodos
cloreto de potássio Sigma P9541
de potássio dibásico Sigma P2222
fosfato de potássio monobásico Sigma P5379
PDMS Dow Corning Sylgar E 184lastomer set. Para a tomada de câmara.
Kwik-Cast Selante Precision Instruments mundo KWIK-CAST Selante de silicone de ação rápida
chapa elétrica Fisher Scientific
Gaiola de Faraday

Referências

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  1. Li, J. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412, 166-169 (2001).
  2. Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope. Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).
  3. Dekker, C.

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Etiquetas

Solid State NanoporesProtein AdsorptionResistive Pulse TechniqueSingle Molecule DetectionNanopore DrillingNitride MembraneIonic Current BlockadePatch Clamp AmplifierProtein Binding AssayTransmembrane Potential

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