Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

Resumo

Um método de usar solid-state nanoporos para monitorar a adsorção não-específica de proteínas em uma superfície inorgânica é descrita. O método emprega o princípio de pulso-resistivo, permitindo a adsorção a ser sondado em tempo real e ao nível de moléculas individuais. Porque o processo de adsorção de proteínas é única longe do equilíbrio, propomos o emprego de matrizes paralelas de nanoporos sintéticos, permitindo que para a determinação quantitativa da taxa de reação aparente de primeira ordem constante de adsorção de proteínas, assim como o de adsorção de Langmuir e constante.

Resumo

Solid-state nanoporos têm sido utilizados para realizar as medições ao nível única molécula para examinar a estrutura local e flexibilidade de ácidos nucléicos ^1-6, o desdobramento de proteínas ⁷ e afinidade de ligação de ligantes diferentes ^8. Ao unir esses nanoporos à técnica de pulso-resistivo ^9-12, tais medições pode ser feito sob uma ampla variedade de condições e sem a necessidade de rotulagem ^3. Na técnica de resistência de pulso, uma solução de sal iônico é introduzido em ambos os lados do nanopore. Portanto, os íons são levados de um lado da câmara para o outro por um potencial transmembrana aplicada, resultando em uma corrente constante. O particionamento de um analito na nanopore provoca uma deflexão bem definidas nesta corrente, que pode ser analisado para extrair informação única molécula. Usando esta técnica, a adsorção de proteínas único para as paredes nanopore pode ser monitorado em uma ampla gama decondições ^13. Adsorção de proteínas está crescendo em importância, porque, como dispositivos microfluídicos encolher de tamanho, a interação destes sistemas com proteínas simples se torna uma preocupação. Este protocolo descreve um ensaio rápido para a proteína de ligação aos filmes de nitreto, que pode ser facilmente alargada a outros filmes finos passíveis de perfuração nanopore, ou em superfícies de nitreto de funcionalizados. A variedade de proteínas pode ser explorado sob uma ampla gama de soluções e condições de desnaturação. Além disso, este protocolo pode ser usado para explorar mais problemas básicos usando espectroscopia nanopore.

Protocolo

1. Fabricação de estado sólido nanoporos em membranas de nitreto de silício

1. Traga TEM FEI Tecnai F20 S / a uma tensão de aceleração de 200 kV. Se estiver usando um S diferentes / TEM, a tensão de aceleração deve ser maior ou igual a 200 kV ⁹
2. Carga de 20 nm de espessura de silício SPI grade janela nitreto no porta-amostras TEM e limpo, com plasma de oxigênio por 30 segundos para remover quaisquer contaminantes do titular.
3. Carregar a amostra para o S / TEM e permitir a vácuo para bombear para baixo. Uma vez que o S / TEM tem bombeado para baixo a vácuo, encontrar a janela de nitreto em bright-campo de modo TEM procurando por um quadrado brilhante no Ronchigram. Verifique se o TEM está alinhada corretamente, harmonizar e concentrar a amostra.
4. Mudar o S / TEM em modo STEM. Use o HAADF detector (ou equivalente) para a imagem da amostra e verifique se ele está devidamente alinhados.
5. Definir o Monocromador para um valor baixo. Um valor mais baixo do Monocromador permite uma maior current de elétrons disponíveis para a perfuração. Se o S / TEM não tem um monocromador, ignore este passo.
6. Selecione um tamanho de local apropriado para a perfuração do nanopore. Isto corresponde ao diâmetro da sonda eletrônica. Uma sonda de 3 nm funciona bem para perfuração de cinco poros nm de diâmetro. A maior sonda (5 nm) irá perfurar mais rapidamente e criar uma maior poro. Uma pequena sonda (1 nm) vai demorar mais tempo para perfurar e criar um pequeno poro.
7. Ajuste os alinhamentos STEM, se necessário.
8. Foco da membrana de nitreto e trazê-lo para uma ampliação de x1.3M. Focando multa deve ser feito através do monitoramento da Ronchigram.
9. Se houver qualquer movimento da amostra, e depois esperar para a amostra se estabilize. Isso pode demorar até uma hora. Em branco o feixe de elétrons enquanto espera de modo a não danificar o nitreto.
10. Coloque a sonda de elétrons sobre a amostra e começar a perfuração.
11. Verificar periodicamente a amostra fazendo a varredura com o detector HAADF, tanto para garantir que o nanopore está sendo drilled (vai parecer uma mancha escura) e para verificar se não há nenhum movimento da amostra. Se a amostra drifts um pouco, ajustar a posição da sonda de elétrons para ser sobre o nanopore.
12. Assista ao Ronchigram para identificar quando o poro se formou. Quando em foco, o filme de nitreto tem uma aparência brilhante. Isso vai desaparecer quando as formas nanopore. Colocando o Ronchigram ligeiramente fora de foco permite ver uma franja Fresnel associado ao nanopore.
13. Pegue uma imagem do nanopore com o HAADF.
14. Fazer um perfil de intensidade da imagem nanopore. O diâmetro do nanopore pode ser estimada pela região mais escura do perfil.
15. Alargamento da nanopore pode ser realizado movendo a sonda de elétrons ao longo das bordas do poro.
16. Uma vez que o nanopore é do diâmetro desejado, coloque o S / TEM em modo TEM.
17. Trazer o Monocromador para sua configuração padrão e usando a imagem do nanopore brilhante campo TEM para confirmar o tamanho

2. Umectação da nanopore de estado sólido

1. De-gás, água deionizada contendo 1 M KCl, 10 mM fosfato de potássio, pH 7,4. Isto pode ser feito colocando as soluções sob vácuo e colocá-los em um sonicador banho por 20 minutos.
2. Colocar o chip de nitreto de silício contendo nanopore em um copo Pyrex 10 ml. Tome cuidado para não quebrar a janela de nitreto, pois é muito delicado. Colocar o copo numa placa de aquecimento em um extractor de fumo e ajustado para 100 ° C.
3. Limpe o chip nanopore com solução piranha com muito cuidado. Primeiro adicionar 3 ml de ácido sulfúrico para o recipiente utilizando uma pipeta de vidro. Em seguida, adicione cuidadosamente uma peróxido de hidrogênio ml para o ácido sulfúrico para fazer piranha solução ^14. Por favor, tome todas as precauções.
4. Permitir que o chip nanopore de molho em solução piranha por 10 minutos.
5. Remover a solução piranha do copo com uma pipeta de vidro. Coloque-o em um recipiente de armazenamento adequada.
6. Fill o copo com a de-gaseados, a água de-ionizada utilizando uma pipeta de vidro limpo. Copo vazio de água e repita pelo menos 5 vezes.
7. Remover o chip nanopore com uma pinça limpa e seque-o por sucção luz
8. Imediatamente, selar o chip nanopore para dentro da câmara (Fig. 2a, 2b). O chip pode ser fixado na câmara por O-rings ou selante de silicone.
9. Encha a câmara com solução KCl
10. Conectar os eletrodos Ag / AgCl para a câmara (Fig. 2b). Eletrodos pode ser feita por imersão em água sanitária fio de prata durante a noite.
11. Aplicar um potencial transmembrana através dos eletrodos e monitorar a resposta atual usando uma Axon 200B amplificador de patch-clamp no modo de tensão-clamp.
12. Construir uma curva I / V (corrente-tensão) a partir das medições. A curva I / V deve ser altamente linear ao usar 1 M KCl (Fig. 3). A condutância da nanopore deve corresponder ao seu diâmetro. Se o nanopore não exibe umalinear I / V curva, a condutância é muito baixo, ou a corrente aberta do nanopore não é estável (Fig. 4a), isso significa que o nanopore não está devidamente molhada e lavagem piranha deve ser repetido.

3. Monitoramento adsorção de proteínas

1. É extremamente importante a realização de experimentos de controle com uma membrana single-nanopore ou matriz paralela de nanoporos (veja abaixo) para monitorar a corrente com as condições de buffer sem a amostra de proteína. Recomendamos as seguintes duas etapas: (i) o uso de um buffer de pureza de nível alto (pureza> 99,9%; cromatografia-grade level), e (ii) o uso de um tampão, cuja interação com o nanopore de estado sólido não produzir um único canal de eventos. Além disso, recomendamos a obtenção de uma amostra de proteína de alta pureza através de procedimentos padrão de química de proteínas. A pureza da amostra de proteínas deve ser verificado pela análise de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e de alta resolução mass espectrometria de ^15.
2. Adicionar uma amostra purificada da proteína a ser estudada no banho fundamentada da câmara. Dê tempo para a amostra para difundir em todo o banho. Concentrações típicas de proteínas que podem ser medidos estão em dezenas de nM a gama M ^7,15-21.
3. Aplicar uma tensão de polarização transmembrana potencial com polaridade oposta àquela da carga total da proteína em estudo. Por exemplo, BSA tem uma carga líquida negativa eficaz em pH 7,4 e, portanto, um viés tensão positiva deve ser aplicada. A voltagem aplicada cria gradiente de potencial no interior nanopore e proteínas de cargas opostas será conduzido por forças opostas. Apenas polaridades de tensão que dirigem as proteínas para o nanopore criará sinais mensuráveis.
4. Um potencial aplicado de 200 mV de magnitude deve ser grande o suficiente para observar a maioria dos analitos de proteína. Eventos aparecem como desvios transitórios atual da linha de base (Fig. 4b).Se nenhum sinal for observado, aumentar a concentração da proteína na câmara. Voltagens mais altas melhorar a relação sinal-ruído. Nanoporos nitreto pode suportar alguns volts.
5. Adsorção de proteínas vai aparecer como de longa duração mudanças na linha de base atual do nanopore (Fig. 4c).

4. Possibilidades de funcionalização dos nanoporos

Existem vários métodos para a aplicação de grupos funcionais para nitreto de silício ^22,23. A maioria dos filmes de nitreto de ter uma fina camada de óxido na parte externa e exposição ao ozônio pode criar uma camada de óxido adicionais, se necessário. Organosilanos diferentes podem ser usados ​​e auto-montados em camadas tais. De particular interesse é aminosilane, que auto-monta e pode ser modificada mais (ácido, ou seja, carboxílicos e aldeídos), permitindo a inspeção de uma série de superfícies orgânicas. Depois de um nanopore foi lavado com piranha e garantidos na Chamber, amina podem ser adicionados diretamente ao banho de câmara com um eletrólito de suporte de 0,5 M TBACl (tetrabutilamónio) e MeOH anidro (metanol), utilizado como solvente. Formação de monocamada pode ser monitorado pela aplicação de um viés de voltagem 400 mV ea medição da queda atual ^23.

5. Determinação da aparente de primeira ordem taxa de reação constante ea constante de adsorção de Langmuir usando arrays nanopore paralelo

5.1 O aparente de primeira ordem de reação constantes de velocidade de absorção e dessorção

Ressalta-se que o aspecto positivo desta metodologia é a sua capacidade de observar adsorção individuais no nível única molécula. As medições de molécula única de adsorção de proteínas em uma superfície inorgânicos podem ser ampliados através do emprego de matrizes paralelas de estado sólido nanoporos. A matriz paralela de nanoporos é necessário devido à necessidade de muitos pores do ensaio para obter estatísticas confiáveiss. Para este fim, o uso de uma matriz nanopore permitiria o acompanhamento das adsorção individual, bem como a medição de vários eventos para análise posterior. Uma série de nanoporos em nitreto de silício pode ser formado pelo protocolo acima simplesmente por múltiplos furos na amostra. Cada nanopore devem ser de tamanho similar. Matrizes de nanoporos de 6x6 ou 7x7 deve ser adequada. Após a adição de analito de proteína na câmara, a corrente irá decair de forma exponencial com uma expressão seguinte:

I _t = I _∞ - (I _∞ - I ₀₎ exp (-k t ')

Aqui, eu _t, denota a corrente em um tempo t experimental. I ₀ é a passagem de corrente através originais da matriz nanopore. I _∞ indica o atual nível de saturação (isto é, infinito). K 'é a taxa de reação aparente de primeira ordem constante, o que pode ser determinada a partir ªe ajuste da curva experimental. A maior k 'pode ser interpretada como uma taxa de adsorção mais rápida. A relação I _∞ / I _0, também chamado de saturação normalizada atual, é um número adimensional entre 0 e 1. Este parâmetro é uma medida da ocupação pela analitos proteína adsorvida. Assim, cada condição distinta experimental deve ser associada a dois parâmetros de saída específico eu _∞ / I ₀ e k '.

Note-se que o aparente de primeira ordem constantes de velocidade de adsorção e correntes normalizados são impactados pelo tempo efetivo gasto por proteínas dentro do nanoporos. Desta vez, é dependente da concentração dos analitos de proteína na fase aquosa em massa ^24. Portanto, a correção adicional desses números precisa ser implementado com base no tempo efetivo gasto pelo proteínas no interior nanopore. Sugerimos a medição da freqüência de fast (translocação) eventos e multiplicando-o pelo tempo médio de permanência de tais eventos. Isto lhe dará o tempo médio de proteínas passou no interior nanopore por unidade de tempo.

A taxa constante de dessorção pode ser determinado usando uma matriz paralela de nanoporos também. Tão logo o nível atual atinge a saturação (I _∞), a tensão deve ser revertida, por isso não mais proteínas estão presos na nanoporos. Dessorção de proteínas individuais será acompanhada pela alteração da corrente registou no sentido de valores maiores. A constante de velocidade será, em seguida, extraído do aumento do nível atual.

5.2 A constante de adsorção de Langmuir

A absorção de proteína analitos nas superfícies inorgânicas dos nanoporos é dependente da concentração de proteína na fase aquosa. Este fenômeno já foi observado no nível de uma única molécula de ^13. Se θ representam s da corrente de saturação normalizada (I _∞ / I _0), então uma típica equação de Langmuir isoterma é dado pela seguinte expressão:

onde C é a concentração de proteína na fase aquosa. α é a constante de adsorção de Langmuir. Isso aumenta constante com um aumento na energia de ligação de adsorção e com uma diminuição na temperatura. A coleta dos pontos de dados θ vai empregar medidas com matrizes paralelas efectuadas nas concentrações de proteínas diferentes na fase aquosa. Dados devem ser analisados ​​em combinação com outras técnicas para verificar a magnitude da constante de adsorção de Langmuir equipado. Além disso, full-atomística simulações de dinâmica molecular ^25,26 pode ser usado também para ajudar as interpretações dos dados obtidos experimental.

title "> 6. Resultados Representante

Os resultados típicos de estado sólido nanoporos será o seguinte. A corrente de poros abertos devem ser altamente estável, como pode ser visto na fig. 4a. As características I / V do nanopore deve ser altamente linear em 1 M KCl, 10 de fosfato de potássio, pH 7,4, como pode ser visto na fig. 2. A inclinação de um ajuste linear à curva I / V fornecerá a condutância unitária do nanopore. A condutância tem uma relação direta com o diâmetro nanopore e deve corresponder a equação: , Onde G é a condutância da nanopore, d é o seu diâmetro, l é o seu comprimento, e σ é a condutividade da solução na câmara ^14. Este valor deve corresponder a até 30%. Se ele for muito pequeno, seu pore não é provável molhada. Com a adição de proteínas, eventos rápida deve seguir-se, como visto na fig. 4b. Protein adsorção é uma gota de vida longa atual como mostrado na figura. 4c. Algumas proteínas são altamente instáveis ​​e sofrem transformação estrutural no interior dos poros. Neste caso, a queda de tensão de longa duração será acompanhado por flutuações rápidas.

Figura 1. Solid-state nanopore fabricados usando um F20 Tecnai S / TEM. Do poro foi perfurado no modo STEM a um diâmetro de 20 nm. A imagem foi tirada no campo de modo brilhante TEM. Nitreto era de 30 nm de espessura.

Figura 2. Chamber utilizado para o alojamento de um nanopore solid-state único pulso-resistivo medições. A Secção) e um chip de silício com free-standing janela de nitreto (grade TEM). O nanopore é perfurado no nitreto antes de carregar. Red O-rings são usados ​​para formar um bomeal sobre o chip, que separa dois banhos de solução iônica. B) Esquema da câmara mostrando a colocação de banhos solução e eletrodos com relação ao nanopore.

Figura 3. Típicos I / V para os traços de estado sólido nanoporos de diferentes diâmetros. Vestígios de canal único elétrica foram realizadas em 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8.5. Nanoporos foram perfurados em 30 de nitreto de silício nm de espessura. Espessura de nitreto de nota vai afetar a condutância unitária do nanopore.

Figura 4. Medido single-channel traços atuais ea detecção de adsorção de proteínas. A) Um traço único canal eléctricas mostrando a corrente aberta de um nanopore diâmetro de 10 nm. B) representam desvios atual de particionamento de albumina de soro bovino (BSA) no interior do nanopore. C) adsorção de BSA sobre a superfície de nitreto. Todos os traços são do nanopore mesmo em 1 M KCl, 10 mM fosfato de potássio, pH 7,4. O potencial transmembrana aplicada foi de 40 mV e BSA foi adicionado ao banho de câmara fundada em uma concentração de 120 nM.

Discussão

Adsorção espontânea de proteínas em estado sólido superfícies ^27-29 é de fundamental importância em várias áreas, tais como aplicações biochip e design de uma nova classe de biomateriais híbridos funcionais. Estudos anteriores mostraram que as proteínas adsorvidas para solid-state superfícies não apresentam mobilidade lateral ou taxas de dessorção significativa e, portanto, adsorção de proteínas é geralmente considerado um processo irreversível e inespecífico ^30-32. Adsorção de proteínas sobre supe...

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Tecnai F20 S / TEM	FEI		S / TEM requer tensão de aceleração ≥ fonte de 200KV e de emissão de campo.
20 nm de espessura de silício janela membrana de nitreto de TEM	SPI	4163SN-BA
Axon Axopatch 200B amplificador de patch-clamp	Dispositivos moleculares
Axon Digidata 1440A	Dispositivos moleculares
pCLAMP 10 software	Dispositivos moleculares		Eletrofisiologia Dados Software Aquisição e Análise
Ácido sulfúrico	FIsher Scientific	A300
peróxido de hidrogênio	Fisher Scientific	H325
silicone O-rings	McMaster-Carr	003 S70	Alternativamente use PDMS
fio de prata	Sigma-Aldrich	348759	Para os eletrodos
SPC Technology, D sub contato, pino	Newark	9K4978	Para os eletrodos
cloreto de potássio	Sigma	P9541
de potássio dibásico	Sigma	P2222
fosfato de potássio monobásico	Sigma	P5379
PDMS	Dow Corning		Sylgar E 184lastomer set. Para a tomada de câmara.
Kwik-Cast Selante	Precision Instruments mundo	KWIK-CAST	Selante de silicone de ação rápida
chapa elétrica	Fisher Scientific
Gaiola de Faraday