Demonstramos como dissecar e cultura pinto gânglio statoacoustic E4 e E6 explantes medula espinhal. Explantes são cultivados sob condições sem soro em gel de colágeno 3D por 24 horas. Neuritos resposta é testado com o meio do fator de crescimento suplementado com proteína e revestido contas.
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Artigo de método
Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os órgãos sensoriais do ouvido interno de frango são inervados pelos processos periféricos do gânglio statoacoustic (SAG) neurônios. Inervação órgão sensorial depende de uma combinação de pistas de orientação axônio 1 e fatores de sobrevivência duas localizadas ao longo da trajetória de axônios em crescimento e / ou dentro de seus alvos órgão sensorial. Por exemplo, interferência funcional com uma via clássica de sinalização de orientação do axônio, Semaforina-neuropilin, gerado misrouting de axônios ótica 3. Além disso, vários fatores de crescimento expressos nas metas sensoriais do ouvido interno, incluindo Neurotrofina-3 (NT-3) e Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), têm sido manipulados em animais transgênicos, mais uma vez levando a misrouting de axônios SAG 4. Essas mesmas moléculas promover a sobrevivência e crescimento de neuritos de neurônios SAG pinto in vitro 5,6.
Aqui, descrevemos e demonstrar o método in vitro estamos atualmente ucantar para testar a capacidade de resposta do neurites SAG pinto de proteínas solúveis, incluindo morfogenes conhecido como o Wnts, bem como fatores de crescimento que são importantes para promover o crescimento SAG neurite e sobrevivência dos neurônios. Usando este sistema modelo, esperamos tirar conclusões sobre os efeitos que ligantes secretados podem exercer sobre a sobrevivência SAG neurônio e crescimento de neuritos.
Explantes SAG são dissecados no dia embrionárias 4 (E4) e cultivadas em géis tridimensionais de colágeno sob condições sem soro por 24 horas. Primeiro, a capacidade de resposta neurite é testada por explantes de cultura suplementado com proteína-médio. Então, perguntar se fontes pontuais de ligantes secretada pode ter efeitos direcionais no crescimento de neuritos, são explantes co-cultivados com proteína revestido contas e ensaiadas para a capacidade do talão até localmente promovem ou inibem a conseqüência. Nós também incluímos uma demonstração da dissecção (protocolo modificado 7) e cultura de explantes E6 medula espinhal. Nósrotineiramente usam explantes medula espinhal para confirmar bioatividade das proteínas e proteína-embebido contas, e verificar as espécies reatividade cruzada com tecido de bico, nas condições mesma cultura como explantes SAG. Estes ensaios in vitro são convenientes para a rápida triagem para as moléculas que exercem tróficos (sobrevivência) ou trópico (direcional) efeitos sobre os neurônios SAG, especialmente antes de realizar estudos in vivo. Além disso, este método permite que o teste de moléculas individuais sob condições sem soro, com alta sobrevivência dos neurônios 8.
Protocolo
Receitas
Pinto Ringers
| 7,2 g | NaCl |
| 0,23 g | CaCl 2 + 2H 2 O |
| 0,37 g | KCl |
| 0,115 g | Na 2 HPO 4 |
| 900 ml | Água (grau de cultura de tecidos) |
Nota: Ajustar o pH para 7,4. Trazer um volume final de 1000 ml com água.
PBS 10X
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 g | Na 2 HPO 4.... |
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Discussão
Nós apresentamos um método para dissecar e cultura SAG E4 e E6 explantes medula espinhal, de bico, sob soro livre de condições. Este procedimento é usado atualmente em nosso laboratório para estudar os efeitos de vários ligantes secretada na sobrevivência SAG neurônio e crescimento de neuritos. Aspectos inovadores deste protocolo incluem o uso de um sistema isento de soro, para explantes cultura eo uso de contas embebido em fatores de crescimento para estudar os efeitos sobre crescimento de neuritos SAG. Um método semel.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant RO1DC002756 ea Purdue Research Foundation. Agradecemos a Doris Chang Wu e Wiese para o conselho com experimentos e McPhail Rodney para ajudar com números.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentário |
| Equipamento | |||
| Microscópio de dissecção | Nós usamos uma Leica M80 estereomicroscópio com brightfield base de iluminação | ||
| Deslize mais quentes | CS & E. | Colágeno polimerização | |
| Frango ovo incubadora | |||
| 37 ° C / 5% CO 2 umidificado de cultura de células incubadora | |||
| Materiais dissecção | |||
| Sylgard &cópia; placa de Petri revestidas | |||
| 24 poços da placa de cultura de células | Corning | 3526 | |
| # 5 Dumont forceps | Multa Ferramentas Ciência | 11252-30 | |
| # 55 Dumont forceps | Multa Ferramentas Ciência | 11295-51 | |
| Pinos de aço inoxidável de dissecação | Multa Ferramentas Ciência | 26002-10 | Embrião pinagem, dissecção fina |
| Moria colher perfurada | Multa Ferramentas Ciência | 10370-17 | Colheita de embriões / transferência |
| 200 mL pontas de pipeta de boca larga | Dot Scientific Inc | 118-96R | Transferência de explante |
| E4 e E6 ovos de galinha | & Nbsp; | ||
| Pinto solução de Ringer | Colheita de embriões | ||
| HBSS | Sigma | H8264 | SAG dissecção |
| L15 médio | Sigma | L5520 | Médio dissecção da medula espinhal |
| Soro fetal bovino | Atlanta Biologicals | S11150 | Médio dissecção da medula espinhal |
| Vannas Tesoura | Precision Instruments mundo | 501778 | Dissecção da medula espinhal |
| Preparação de colágeno | |||
| Rat-tail colágeno tipo I | BD Biosciences | 354249 | Cultura de explantes |
| PBS 10X (estéril) | Para neutralize colágeno | ||
| NaOH 1N (estéril) | Para neutralizar colágeno | ||
| Água destilada (estéril) | Para neutralizar colágeno | ||
| pH papéis indicador (6,0-8,1) | Whatman | 2629-990 | Para verificar o pH colágeno |
| 15 ml tubos cônicos | Dot Scientific Inc | 818-PG | |
| 500 mL pontas de pipeta de boca larga | Dot Scientific Inc | 119-R100 | Ao colágeno pipeta |
| Cultura de explantes | |||
| DMEM/F12 médio | Sigma | D8437 | Explante meio de cultura |
| ITS 1 | Sigma | I2521 | Suplemento médio |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | Suplemento médio |
| CNTF (rato) | Sigma | C3835 | Suplemento médio |
| NT-3 (humano) | Sigma | N1905 | Suplemento médio |
| Purificada do mouse Wnt5a | R & D Systems | WN-645-010 | |
| Affi-gel gel contas azuis | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Imuno-histoquímica | |||
| Paraformaldeído | Sigma | P6148 | Fixação |
| PBS | Lavagens | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Solução de bloqueio |
| Sódioazida | Sigma | S8032 | Solução de bloqueio |
| Soro bovino | Invitrogen | 16170-078 | Solução de bloqueio |
| Monoclonal anti-tubulina IgG2b β 1 + anticorpo II | Sigma | T8535 | Etiquetas corpos celulares e neurites |
| Alexa flúor 488 cabra anti-rato IgG2 de anticorpos b | Invitrogen | A21141 | Detecta anticorpos β tubulina |
| Teflon micro espátula | VWR | 57949-033 | Géis de colágeno liberação do bem |
Referências
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.....
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Reimpressões e permissões
