Artigo de método

Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

DOI:

10.3791/3604

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11 de março de 2012

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos um método para o uso de espectrometria de massa MALDI e química metilação redutiva para quantificar as mudanças na metilação da lisina.

Resumo

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Recentemente, os reguladores epigenéticos têm sido descobertos como atores-chave em muitos diferentes doenças 1-3. Como resultado, estas enzimas são alvos principais para os estudos de moléculas pequenas e 4 desenvolvimento de drogas. Muitos reguladores epigenéticos têm apenas recentemente descobertos e ainda estão em vias de ser classificado. Entre estas enzimas são demethylases lisina que removem grupos metilo a partir de lisinas na histonas e outras proteínas. Devido à natureza novo desta classe de enzimas, ensaios de poucos têm sido desenvolvidos para estudar a sua actividade. Este tem sido um bloqueio na estrada para tanto a classificação e estudo de alto rendimento de demethylases histonas. Atualmente, ensaios demetilase existem poucos. As que existem tendem a ser de natureza qualitativa e não pode discernir entre simultaneamente os diferentes estados de metilação de lisina (un-, mono-, di-e tri-). Espectrometria de massa é comumente usado para determinar a atividade demetilase mas atuais ensaios de espectrometria de massa donão dirigir se peptídeos diferencialmente metilados ionizar de forma diferente. Ionização diferencial de péptidos metilados faz comparando estados de metilação difícil e certamente não quantitativa (Figura 1A). Assim, os ensaios disponíveis não são otimizados para a análise global da atividade demetilase.

Descrevemos aqui um método chamado MassSQUIRM (quantificação por espectrometria de massa utilizando metilação redutiva isotópica) que é baseado em metilação redutiva de grupos amina com formaldeído deuterado para forçar todos os lisinas ser di-metilado, tornando-as assim essencialmente os mesmos espécies químicas e, portanto, ionizar o mesmo (Figura 1B). A diferença química apenas após a metilação redutiva é hidrogénio e deutério, que não afecta a eficiência de ionização MALDI. O ensaio MassSQUIRM é específico para produtos de reacção desmetilase com lisinas un-, mono-ou di-metilados. O ensaio é também aplicável a metiltransferases lisina dando o same produtos de reacção. Aqui, nós usar uma combinação de química metilação redutiva e espectrometria de massa MALDI para medir a actividade de LSD1, um desmetilase lisina capaz de remover di-e mono-metilo grupos, sobre um substrato de péptido sintético 5. Este ensaio é simples e facilmente acessíveis a qualquer laboratório com acesso a um espectrómetro de massa MALDI em laboratório ou através de um mecanismo proteômica. O ensaio tem ~ gama de 8 vezes dinâmico e é prontamente adaptar ao formato de placa 5.

Protocolo

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Este protocolo é modificado a partir de Blair et al. 6.

1. LSD1 Ensaio desmetilação

  1. Em um volume final de 20 uL, combinar 125 ng LSD1 recombinante com 0,25 ug de di-metil histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) em tampão de desmetilase (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM de KCl, 5 mM MgCl2, 5% glicerol). Além disso, realizar um péptido de controlo sozinha, sem enzima. O controle é para a secção 3 e não precisa de metilação redutiva.
  2. Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
  3. Para recolher os péptidos, adicionar 8 uL Poros R2 20 micron grânulos para cada amostra e agitar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Preparar grânulos Poros suspendendo 1 volume de esferas com um volume de metanol, e depois adicionar 10 volumes de 5% de ácido fórmico / TFA a 0,2%.
  4. Condição dois C 18







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Discussão

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MassSQUIRM é um método barato e quantitativa para análise abrangente da atividade de demethylases lisina envolvidas na mono-e di-metilação. MassSQUIRM oferece não só a quantificação do produto da reacção, mas também para os intermediários. Este ensaio pode ser utilizado como uma ferramenta poderosa para estudar o mecanismo de LSD1 e outros demethylases histona. Também irá ser útil para a classificação de muitas enzimas recém-descobertas desmetilase de lisina, tais como PHF8 e poderiam ser usados ​​para certos enzimas me...

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Divulgações

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Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos ao UAMS Facilidade Proteomics de apoio por espectrometria de massa. O financiamento para este projeto foi fornecido pelo NIH concede P20RR015569, P20RR016460 e R01DA025755.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo
LSD1 BPS Biosciences 50100
H3K4me2-biotina péptido preparada em casa nenhum
POROS R2 20 esferas de micro Applied Biosystems 1-1129-06
C 18 ZipTip Millipore ZTC18M
Ácido trifluoroacético (TFA) Thermo 28904
acetonitrila Pescador A996
2,5-di-hidroxibenzóico Sigma 85707
Borano dimetilamina Sigma 180238
isotopicamente pesado d 2-formaldeído Cambridge Isotope Laboratories DLM-805-20
Tris Pescador BP154
KCl Pescador BP366
MgCl 2 Pescador BP214
Glicerina Pescador G33
O ácido fórmico Fluka 06440
Metanol Pescador A452
Na-fosfato Pescador BP329
Concentrador Speedvac Sábio DNA110
MALDI-prOTOF espectrômetro de massa e TOFworks software PerkinElmerSciex nenhum

Referências

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  1. Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  3. Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
  4. Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
  5. Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
  6. Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
  7. Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
  8. Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
  9. Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genetics. 179, 291-304 (2008).
  10. Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).

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