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1. Isolando derivadas de tecido adiposo células-tronco (ASC)
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Isolar adiposo epididimal e perirenal rato e lavar com solução de Hank estéril tamponada de sal (HBSS) contendo 1% de soro fetal bovino (FBS), como descrito anteriormente 6.
- Picar o tecido e transferir 1-2 g em 25 mL de HBSS contendo FBS a 1% para um tubo de 50 mL e centrifugação a 500 g durante 8 minutos à temperatura ambiente.
- Recolher o de flutuação livre camada de tecido adiposo e transferência para 125 mL balão Erlenmeyer e trata-se com 25 mL de colagenase tipo II (200 U / mL) em HBSS durante 45 min a 37 ° C num agitador orbital (125 rpm).
- Cuidadosamente remover a fracção de líquido (abaixo de óleo e da camada adiposo) e filtrar sequencialmente através de um filtro 100-iM e 70 mícrons de nylon de malha. Centrifugar o filtrado a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente, aspirar o supernatant, e lavar a pelete duas vezes com 25 ml de HBSS.
- Ressuspender o sedimento de células em 50 mL de meio de crescimento (Meio MesenPRO RS Basal) suplementado com MesenPRO Suplemento de Crescimento RS, antibiótico-antimicótico (100 U / mL de penicilina G, 100 ug / mL de sulfato de estreptomicina, e 0,25 ug / mL Anfotericina B) , e 2 mM de L-glutamina e as células de pipeta em 2 T75 frascos (25 ml balão /).
- Cultura da ASC em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C (passagem 2-4 ASC são utilizados para todas as experiências).
2. Preparação de microesferas (CSM)
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- CSM são preparados por um processo de emulsificação de água-em-óleo, juntamente com uma técnica de coacervação iónica usando o nosso protocolo anterior 6. Emulsionar uma solução aquosa de quitosano (6 mL de 3% w / v de quitosano em ácido acético 0,5 M) em 100 ml de uma mistura de fase de óleo consistindo de sojaóleo, n-octanol (1:2 v / v) e 5% de sorbitano-mono-oleato de emulsionante (Span 80), utilizando sobrecarga (1700 rpm) e agitação magnética (1000 rpm), simultaneamente, em direcções opostas. Este método de dupla resultará uma mistura que micelas formadas no início antes de reticulação ocorre podem permanecer em solução e não assentam no fundo. Além disso, a barra de agitação magnética SIDA em DE-agregação de quitosano durante micela formação e rigidization.
- A mistura é agitada continuamente durante aproximadamente 1 hora até uma emulsão de água-em-óleo estável é obtido. Reticulação iónica é iniciada com a adição de 1,5 mL de 1% de hidróxido de w / v de potássio em n-octanol min a cada 15 durante 4 h (24 ml no total).
- Depois de se completar a reacção de reticulação, lentamente decantar a fase de óleo da mistura contendo CSM e imediatamente adicionar as esferas a 100 mL de acetona. Lave as esferas com acetona até que a fase de óleo é completamente removido.
- Secam-se as esferas recuperados em um exsicador de vácuo e analyze inalterado. O tamanho médio de partícula CSM, área de superfície por miligrama e da unidade de volume cúbico foi determinada utilizando analisador de tamanho de partícula.
- Para as experiências subsequentes, lavar CSM três vezes com água estéril para remover os sais residuais e esterilizar com álcool absoluto.
3. Determinando o número de grupos amino livres no CSM
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Determinar o número de grupos amino livres presentes na CSM após reticulação iónica usando o ensaio de ácido benzenossulfónico trinitro (TNBS), de Bubins e Ofner 7. Incubar 5 mg de microesferas com 1 mL de 0,5% de solução de TNBS em um tubo de vidro de 50 mL durante 4 h, a 40 ° C e hidrolisar com a adição de 3 mL de HCl 6N a 60 ° C durante 2h.
- Arrefecer as amostras à temperatura ambiente, e extrair os TNBS livres por adição de 5 mL de água desionizada e 10 mL de acetatoéter.
- Aquecer uma alíquota de 5 ml da fase aquosa para 40 ° C num banho de água durante 15 min para evaporar qualquer éter residual, arrefecer até à temperatura ambiente, e diluir com 15 mL de água.
- Medir a absorvância a 345 nm com um espectrofotómetro com solução TNBS sem quitosana como em branco eo quitosano utilizado para a preparação CSM para determinar o número total de grupos amino. Estimar o número de grupos amino livres da MSC em relação ao quitosano.
4. Carregando ASC no CSM
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Equilibrar 5 mg de CSM esterilizado de seção 2,5 em HBSS estéril durante a noite e adicionar um poro tamanho 8 mícrons membrana inserção placa de cultura (24-bem placa).
- Após o CSM se estabeleceram para a membrana, aspirar cuidadosamente os HBSS e adicionam-se 300 uL de meio de crescimento para o interior da inserção e 700 uL de meio de crescimento para the fora da pastilha.
- Ressuspender o ASC na concentração apropriada (1 x 10 4 a 4 x 10 4) em 200 uL de meio de crescimento e de sementes ao longo do CSM dentro do inserto placa de cultura. O volume final de meio de cultura dentro da inserção, após a semeadura, é de 500 uL.
- Incubar a seeded ASC à CSM por 24 h em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.
5. Determinação da porcentagem de ASC Carregando e viabilidade celular em CSM
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Após a incubação, recolher o CSM ASC-carregado num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril, sem perturbar as células que migraram para a membrana de inserção.
- Remover o meio residual e adicionar 250 uL de meio de crescimento fresco para o tubo.
- Para cada tubo 25 uL de MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazólio]solução (5 mg / mL) e incubar durante 4 h em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.
- Após a incubação, o meio de remover, adicionar 250 uL de sulfóxido de dimetilo, e vórtice a mistura durante 2-5 minutos para solubilizar o formazan complexo.
- Centrifugar a CSM em 2700 X g durante 5 min, e determinar a absorvância sobrenadante medida a 570 nm 630 nm, utilizando como referência.
- Determinar o número de células associado com o MSC em relação ao valor de absorvância obtidos a partir de um número conhecido de ASC viável.
6. Caracterizando ASC-CSM-incorporado gel de colágeno
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Mistura ASC-carregado CSM (5 mg contendo ≈ 2 x 10 4 células) com colagénio de tipo 1 (7,5 mg / mL), extraído a partir de tendão da cauda de rato de acordo com o método de Bornstein 8 e fibrilam depois de ajustar o pH para 6,8 utilizando 2 N de NaOH.
Adicionar a mistura de colagénio-ASC-CSM fibrilada para uma placa de 12 poços e incubar durante 30 min a uma em 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C. - Depois de fibrilação completa, incubar os géis de colagénio-ASC-CSM-se até 14 dias, em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.
- Libertação e migração de células de CSM no gel foram observadas utilizando técnicas de microscopia padrão.
7. Os resultados representativos
No presente estudo, nós desenvolvemos uma estratégia in vitro para proporcionar células-tronco de microesferas de quitosano (CSM) em um gel de colagénio andaime. CSM poroso de tamanho uniforme (175-225 um de diâmetro) e composição foram preparados e utilizados como transportadores de células (Figura 2). Após a incubação com a ASC CSM, as células ligado a uma concentração de 2 x 10 4 cells/5mg de MSC. As células foram capazes de espalhar sobre a microesfera, enquanto estende filopodiosnas fendas porosas do microesfera (Figura 3). Uma vez que a célula CSM-carregado foram misturadas com o gel de colagénio, as células imediatamente começou a migrar para os géis (Figura 4).
Tabela 1. Vantagens biológicos para o uso de quitosano e de colagénio em um sistema de entrega de células estaminais.
Figura 1. Esquemático que representa a estratégia geral para a utilização dupla de ASC-CSM andaimes de colagénio carregados. Figuras 2, 3 e 4 são anotadas no interior da esquemática para auxiliar com a interpretação das imagens.
Figura 2. Representação esquemática representando o processo de semear as células estaminais para quitosano. O process envolve co-cultura com ASC CSM em um 8 - mM tamanho dos poros da membrana de inserção placa de cultura. Após 24 horas, as microesferas são removidos do inserto e estão prontos para incorporação numa matriz biomaterial.
Figura 3. Caracterização morfológica de CSM-carregado com ASC. O painel A representa uma micrografia de luz de ASC-carregado CSM, enquanto o painel B mostra o mesmo campo de visão, sobreposto com uma imagem obtida por microscopia de fluorescência confocal. ASC foram pré-carregado com calceína AM (verde). O painel C mostra uma imagem de uma imagem SEM de uma microesfera descarregado, enquanto o painel D mostra células carregadas no microesfera (asteriscos). A imagem MET em E painel mostra uma secção transversal de uma microesfera descarregado. Uma multidão de poros e fendas estão localizados ao longo da microesfera. Painel F mostra uma microesfera transversalmente com as células (setas) ligado e estendendo filopodia na CREvícios. Ampliações originais: A & B = 70X; C = 500x, D = 2.000 x; E & F = 2.500 x.
Figura 4. A migração de ASC a partir do CSM para o colagénio tridimensional andaime. Os painéis A e B representam a CSM com células migrando do microesfera e para dentro da matriz de colagénio no dia 3 (A setas,). O painel B mostra uma cultura semelhante depois de 12 dias. Microscopia electrónica de transmissão (TEM) imagens são representadas em C, D e E. Os asteriscos em C e D mostram uma microesfera que tem sido transversalmente com as células de migrar para longe da microesfera (setas). Maior ampliação de painel D está representado na painel E, e mostra filopodia célula ligado às fibrilas de colagénio (inserção). Aumento original: A & B = 100x; C & D = 6.000 x; E = 20.000 x, inset = 150.000 x.
Figura 5.Esquema representando os usos vastas CSM na medicina regenerativa e entrega da droga.