Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse 1 H NMR Spectroscopy

Resumo

Um procedimento de colonização progressiva é descrito para melhor avaliar seu impacto sobre o metabolismo hepático host. Colonização é monitorado não invasiva através da avaliação da excreção urinária de microbiana co-metabólitos por RMN baseado em perfil metabólico, enquanto o metabolismo hepático é avaliado pela Alta Resolução Magia Angle Spinning (MAS HR) NMR perfil da biópsia intacta.

Resumo

É bem conhecido que as bactérias do intestino contribuir significativamente para a homeostase host, fornecendo uma gama de benefícios como a proteção imunológica e síntese de vitaminas. Eles também fornecem o host com uma quantidade considerável de nutrientes, fazendo com que este ecossistema um órgão metabólicas essenciais. No contexto da crescente evidência da relação entre a flora intestinal e síndrome metabólica, a compreensão da interação metabólica entre o anfitrião e sua microbiota intestinal está se tornando um desafio importante da biologia moderna. ^1-4

Colonização (também referida como processo de normalização) designa o estabelecimento de micro-organismos em um animal livre de germes ex. Embora seja um processo natural que ocorre no nascimento, é também utilizado em adulto livre de germes animais para controlar o ecossistema intestinal floral e ainda determinar o seu impacto sobre o metabolismo hospedeiro. Um procedimento comum para controlar o processo de colonização é a utilização do método de gavagem com um single ou uma mistura de micro-organismos. Este método resulta em uma colonização muito rápido e apresenta a desvantagem de ser extremamente estressante ^5. Portanto, é útil para minimizar o estresse e obter um processo mais lento de colonização para observar gradualmente o impacto da criação de bactérias sobre o metabolismo hospedeiro.

Neste manuscrito, nós descrevemos um procedimento para avaliar a modificação do metabolismo hepático durante um processo de colonização gradual utilizando uma técnica não destrutiva de perfil metabólico. Propomos para monitorar a colonização microbiana do intestino através da avaliação da atividade metabólica microbiana do intestino refletida pela excreção urinária de microbiana co-metabólitos por ^um perfil H RMN baseado metabólica. Isto permite uma apreciação da estabilidade da atividade microbiana do intestino, além do estabelecimento estável do ecossistema microbiano do intestino geralmente avaliado pelo monitoramento bactérias fecais por DGGE (eletroforese em gel de gradiente de desnaturação). ⁶ Acolonização ocorre em um ambiente convencional aberta e é iniciada por uma maca, suja de animais convencionais, que servirá como controle. Roedores são animais coprófagos, isso garante uma colonização homogênea como descrito anteriormente. ⁷

Perfil metabólico hepático é medido diretamente a partir de uma biópsia do fígado intacto utilizando ¹ H Angle Magia Alta Resolução Spinning espectroscopia de RMN. Esta técnica semi-quantitativa oferece uma forma rápida de avaliar, sem danificar a estrutura da célula, os principais metabolitos, tais como triglicérides, glicose e glicogênio, a fim de estimar mais a complexa interação entre o processo de colonização e do metabolismo hepático ^7-10. Este método também pode ser aplicado a qualquer tecido biópsia ^11,12.

Protocolo

1. Colonização do germe-free animais e coleta de amostras

1. Remover livre de germes animais de isoladores e abrigá-los em uma sala de criação em gaiolas convencionais equipados com filtro na frente dos animais convencionais, que servirão como controles (Figura 1).
2. Meia mistura do lixo (3 dias) retirado da gaiola de controle convencional, com a ninhada dos animais germ-free. Mantenha sempre 1 / 3 do lixo sujos convencionais cada vez que é necessário renová-lo, a fim de manter um nível de bactérias (mantê-lo pelo menos por 3 dias).
3. Coletar a urina em um microtubo 1,5 mL manipulando o mouse sobre o tubo e ajudar a micção por massagem suave do intestino. Snap-congelar imediatamente em nitrogênio líquido. Armazenar pelo menos a -40 ° C até a análise de RMN. Um volume mínimo de 20 mL é necessário para a aquisição com uma sonda de RMN de 5 mm, mas é recomendado o uso de 30 mL para melhorar a qualidade do perfil metabólico.
4. Os animais devem be sacrificados sem o uso de qualquer anestésico para evitar ressonâncias de RMN de confusão devido ao metabolismo hepático de compostos anestésico (por exemplo, use deslocamento cervical seguido de confirmação de morte por sangria)

2. Recomendação para coleta de biópsia hepática

1. Não use nenhum produto que contenha álcool para evitar a contaminação. Lavar as ferramentas usando uma solução de água ou soro fisiológico.
2. Não perfurar vesícula biliar. Em caso de vazamento de bile, lave o tecido imediatamente com água ou soro fisiológico.
3. Recolher biópsias hepáticas (cerca de 15-50 mg) do lóbulo esquerdo, como mostrado na Figura 2. Para biópsias reprodutível, recolher de forma consistente no centro do lobo esquerdo evitando as áreas periféricas onde o tecido é mais fina.
4. Snap biópsias congelar em nitrogênio líquido e armazená-los imediatamente a -80 ° C até a análise de RMN.

3. RMN ¹ H aquisição de urina microvolume

Prepare 0.2M de sódio em solução tampão fosfato D2O (99,8%), pH 7,4 contendo 1 mM 3 - (trimetilsilil) do ácido propiônico _d-4 (TSP).

Misturar 30 mL de urina com 30 mL de tampão fosfato de sódio.

Transferir 50 mL de solução mista em 1,7 milímetros do tubo de RMN capilar (Figura 3) (2) usando uma seringa de vidro 50 mL equipado com uma agulha de metal (OD 0,5 mm). Ter cuidado para evitar bolhas.

Coloque o adaptador capilar (Figura 3) (3) no topo da amostra de urina contendo capilar e colocá-lo em um microtubo de RMN de 2,5 mm para 5 milímetros sonda de RMN (Figura 3) (1). Use esta combinação de tubos como um regular tubo de RMN de 5 mm para aquisição espectral.

Use a haste de extração (Figura 3) (4) para remover capilar de 2,5 mm por tubos de RMN aparafusar o adaptador capilar com cuidado para retirá-la.

. 4 ¹ H RMN HR MAS de tecido de biópsia hepática: a preparação da amostra

1. MAS rotor componentes e ferramentas sãodescrito na Figura 4.
2. Inserir biópsia (cerca de 15-50 mg) em rotor de zircônio (Figura 4) (1) e preencher o resto do volume com pura D ₂ O NMR para bloqueio. Tenha cuidado para não fazer quaisquer bolhas porque isso iria alterar a qualidade dos calços subsequente e qualidade de aquisição de dados.
3. Inserir 50 espaçador Teflon mL (Figura 4) (2) com o parafuso cilíndrico (Figura 4) (5). Desapertar-lo e calibrá-lo usando o medidor de profundidade do lado curto (Figura 4) (8). Nesta etapa, é importante prestar uma atenção específica para a amostra porque parte dela pode vazar pelo buraco espaçador. Se este for o caso, então parte da biópsia é destruído e peso da amostra não é mais confiável. Assim, é necessário começar de novo desde o início da preparação da amostra.
4. Coloque o pino thead (Figura 4) (3) e aperte-o suavemente com a chave de fenda (Figura 4) (6). Secar toda a água residual com um pedaço de tecido.
5. Coloque a tampa (Figura 4) (4) nasuperior do rotor e inseri-lo no embalador rotor (Figura 4) (6). Pressione com firmeza até que a tampa está no lugar. Não deve haver qualquer espaço deixado entre o rotor e sua tampa.
6. Marca a metade da parte inferior do rotor usando uma caneta preta para permitir a detecção óptica taxa de spin.
7. Coloque o rotor dentro do espectrômetro de RMN e começar a girar em 5 kHz. Adquirir ^um espectro de RMN H utilizando seqüência de pulsos CPMG ¹³ de acordo com as orientações do fabricante.
8. Use α ressonância glucose anomérico em 5,22 ppm (doublet) para calibrar espectros de RMN.
9. Para descompactar o rotor, proceder por remover a tampa usando o removedor cap (Figura 4) (9). Desapertar thead pin e remover espaçador de teflon com o parafuso cilíndrico. Lavar bem com água e detergente.

5. Resultados representante

Atividade microbiana do intestino pode ser monitorado usando perfil metabólico urinário. Um grande número de micróbios urináriaco-metabólitos identificáveis ​​por ¹ H RMN têm sido descritos na literatura ^7,14-17. Estes microbiana co-metabólitos são particularmente úteis para monitorar o processo de colonização como eles fornecem uma maneira rápida e não-invasivo para estimar quando o ecossistema recém-criada é estável. Figura 5A ilustra claramente o aparecimento de micróbios do intestino co-metabólitos sobre o processo de colonização. Esta figura mostra um perfil metabólico urinário obtidas mediante o procedimento descrito no Passo 2 para um animal colonizadas 20 dias usando o procedimento descrito no Passo 1. Este animal não excretar qualquer sulfato de indoxil e quantidades muito pequenas de phenylacetylglycine (PAG) e sulfato de p-cresol no estado livre de germes (dia 0-azul). Como a colonização avança, estes três marcadores do metabolismo de proteínas pela microbiota intestinal aumentam consideravelmente para chegar a um equilíbrio no dia 20 (vermelho). Isto é particularmente fácil de monitorar, por um grupo de animais, como ilustrado na Figura 5B usando o PAGressonância. Este diagrama foi obtido pela integração da área sob a ressonâncias destaque em cinza na Figura 5A (δ 7,40-7,43), correspondendo a uma ressonância específica (trio) de PAG para um grupo de sete animais.

¹ H Alta Resolução Angle Spinning Magia (MAS HR) espectroscopia de RMN é uma técnica não destrutiva que permite aquisições rápida e reprodutível de perfis metabólicos de qualquer tipo de biópsia ^18. Neste protocolo, utilizamos esta técnica poderosa para obter um perfil metabólico hepática de 2 ratos antes (azul) e após (vermelho) colonização (Figura 6). Esta figura ilustra bem a informação que pode ser derivado de uma MAS RMN baseado em perfil metabólico. Numerosos aminoácidos, assim como metabólitos derivados do metabolismo energético, como a glicose, glicogênio, lactato, triglicérides, (D)-3-hidroxibutirato e nicotinurate pode ser visualizado. Estes perfis também contêm informações relevantes ao estresse oxidativo (ascórbico ou seja, umcid, glutationa), o metabolismo de nucleotídeos (ou seja, inosina, uridina) e metabolismo metilamina (ie colina, Trimetilamina-N-óxido). Neste exemplo, é muito claro que o livre de germes do mouse exibe quase nenhum glicogênio e quantidades muito baixas de glicose e triglicérides como foi publicado anteriormente ^7.

Figura 1. Visão geral do protocolo de colonização. Animais livres de germes e convencionais são alojados em gaiolas equipadas com filtros de lado a lado e suas ninhadas são trocadas para permitir a colonização progressiva da microbiota intestinal convencional (1). Atividade microbiana do intestino é monitorado usando ^um perfil metabólico H NMR-based (2-3). Metabolismo hepático é avaliado por ^um MAS RMN HR H-base de perfis metabólicos (4-5).

Figura 2. Rato vivoanatomia r. O fígado é apresentado como o lado plano do órgão enfrenta a mesa. Para biópsias reprodutível, é aconselhável sempre coletar amostras do centro do lobo esquerdo como indicado pelo retângulo tracejado.

Figura 3 1,7 milímetros kit NMR capilar para trabalhar com microvolumes-chave:.. 1: 2,5 microtubo NMR mm, 2: 1,7 mm tubo de RMN capilar, 3: adaptador capilar, 4: Extração rod.

. MAS Figura 4 equipamentos rotor-chave:. 1: rotor MAS, 2: 50 espaçador Teflon mL, 3: thead pinos, 4: cap, 5: parafuso cilíndrico, 6: chave de fenda, 7: rotor embalador, 8: medidor de profundidade.

Figura 5. Evolução dos perfis metabólicos urinários durante colonization.

1. Zoom na região aromática do espectro entre 6,8-7,8 ppm, onde co-metabólitos microbianos podem ser visualizados. Espectros de RMN ¹ H foram obtidos a partir de um único indivíduo no dia 0 (azul), 4 (verde), 15 (laranja) e 20 (vermelho) pós-colonização. A zona cinzenta corresponde à área que foi integrado para fazer o diagrama em B. chave: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; indoxil-S: sulfato de indoxil;:; Seus p-Cresol-S Histidina: sulfato de p-Cresol; PAG : Phenylacetylglycine.
2. Concentração PAG média durante a colonização (n = 7). Teste t de Student foi utilizado para comparar a diferença na concentração de PAG em vários pontos temporais: a: p <0,05 em relação ao dia 0; b: p <0,01 em relação ao dia 10.

Figura 6. Típicos 600 MHz ¹ H HR espectros de RMN MAS de biópsias hepáticas derivadas de livre de germes (azul) e ex-germ-free (red) camundongos. Prótons em negrito são responsáveis ​​pela ressonância triglicérides-chave:. 3-HB: 3-hidroxibutirato, GSH: glutationa reduzida, TGs: Triglicerídeos, TMAO: Trimetilamina-N-óxido.

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um procedimento colonização progressiva em um ambiente aberto para investigar o impacto da microbiota intestinal no metabolismo hepático avaliado por ¹ H RMN HR MAS perfil da biópsia intacta. Vários métodos de colonização têm sido descritos na literatura. Os métodos mais comuns para colonizar animais com microbiota definida são gavagem oral ou água contaminada ^19,20. Inoculação de fezes também pode ser usado como descrito anteriormente ^21. O método de coloniz...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Microtubo 2,5 milímetros	Nova Era	NE-H5/2.5-V-Br
1,7 milímetros tubo capilar	Sigma-Aldrich	NORS175001
Adaptador capilar	Nova Era	NE-325-5/1.7
Extração da haste	Nova Era	NE-341-5
HR-MAS BL4 rotor com 50 mL kit espaçador esférica Teflon	Bruker	HZ07213
Kit de ferramentas para 50 inserções mL	Bruker	B2950
Antecedência III 600MHz NMR	Bruker
1 H RMN HR MAS sonda sólida	Bruker
Óxido de deutério 99,9%	Sigma-Aldrich	530867-1L
3 - (trimetilsilil) propiônico ácido-d 4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913