Para compreender como as formas de células complexas, como dendritos neuronais, são alcançados durante o desenvolvimento, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método imuno etiquetagem robusta para analisar a organização dos microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica neurônio sensorial, traquéia, músculos e outros Drosophila Larva tecidos parede do corpo.
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Artigo de método
Labeling imuno dos microtúbulos no Dendrites neurônio sensorial, traquéias, e Músculos no Drosophila Wall Corpo Larva
Neste artigo
Resumo
Resumo
Para entender como as diferenças de formas complexas de células são alcançados, é importante seguir precisamente organização de microtúbulos. A Drosophila parede do corpo larval contém vários tipos de células que são modelos para o estudo celular e morfogênese do tecido. Por exemplo traquéias são usados para examinar morfogênese tubo 1, ea arborização dendrítica (DA) neurônios sensoriais da larva Drosophila tornaram-se um sistema primário para a elucidação da geral e neurônio-específico de classe mecanismos de diferenciação 05/02 dendríticas e degeneração 6 .
A forma de ramos dendríticos podem variar significativamente entre as classes de neurônios, e até mesmo entre os diferentes ramos de um único neurônio 7,8. Estudos genéticos em neurônios DA sugerem que a organização do citoesqueleto diferencial pode subjacentes diferenças morfológicas na forma ramo dendríticas 4,9-11. Nós fornecemos um método de etiquetagem robusta imunológica a umssay in vivo organização de microtúbulos em DA neurônio sensorial dendrite arbor (Figuras 1, 2, Movie 1). Este protocolo ilustra a dissecção e imunomarcação de larva de primeiro ínstar, uma fase em conseqüência dendrito ativo neurônio sensorial e organização ramificação está ocorrendo 12,13.
Além da coloração neurônios sensoriais, este método obtém etiquetagem robusta de organização de microtúbulos nos músculos (Filmes 2, 3), traquéia (Figura 3, Movie 3), e tecidos outra parede do corpo. É valioso para pesquisadores que desejam analisar a organização de microtúbulos in situ na parede do corpo quando se investiga os mecanismos que o tecido de controle e forma da célula.
Protocolo
1. Preparação de reagentes
Notas antes de começar: dissecção e coloração imuno-histoquímica são realizadas em uma câmara magnética ea larva é preso utilizando os pinos de insetos com formato especial. Instruções detalhadas sobre a construção de uma câmara magnética, ea preparação desses pinos pode ser encontrada nas referências relacionadas 14,15. Em resumo, um buraco quadrado 1x1cm é cortada em uma folha magnética e uma lamela afixada na parte traseira da folha para fazer uma pequena câmara. Os lados da câmara são selados com cola epóxi, após esta cola não definiu a câmara é lavado várias vezes com etanol 70% an....
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Discussão
Para entender o quão complexo formas de células são alcançados, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método etiquetagem robusta imuno ensaio para a organização de microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica de neurônios sensoriais. Além da coloração neurônios sensoriais, este método obtém coloração imuno robusto de traquéia, músculos e tecidos outra parede do corpo.
Nós usamos esse protocolo para examinar organização de microtúb.......
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Divulgações
Não temos nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a RIKEN para financiamento. P10-Gal4 foi um presente tipo de Alain Vincent (Université Paul Sabatier, Toulouse, França).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Catálogo número | Comentários (Opcional) |
| Fórceps | Dumont | 11251-20 | |
| Microtesoura | FST | 15000-08 | |
| Do mouse anti-α-tubulina (Clone: DM1A) | Sigma | T9026 | Diluição 1 / 1000 |
| Rato anti-Futsch (Clone: 22C10), sobrenadante | Desenvolvimento Estudos Hibridoma Banco | 22C10 | Diluição 1 / 1000 |
| Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Diluição 1 / 1000 |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11001 | Diluição 1 / 500 |
| Cy3 IgG anti-rato | Immunoresearch Jackson | 712-166-150 | Diluição 1 / 200 |
Referências
- Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in....
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Reimpressões e permissões
