Este protocolo de vídeo demonstra um novo método para a geração e subsequente purificação de células progenitoras neuronais a partir de uma fonte renovável de células estaminais neurais (NSCs) com base na sua (granulosidade tamanho e interno) física e propriedades fluorescentes usando tecnologia de citometria de fluxo.
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Artigo de método
O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células estaminais neurais (NCCC) podem ser isoladas e expandidas em grande escala, utilizando o ensaio de neuroesfera e diferenciados para as três principais tipos de células do sistema nervoso central (SNC), ou seja, astrócitos, oligodendrócitos e neurónios. Estas características tornam haste neural e células progenitoras uma valiosa fonte renovável de células para estudos in vitro, como o rastreio de drogas, neurotoxicologia e electrofisiologia e também para a terapia de substituição de células em muitas doenças neurológicas. Na prática, contudo, a heterogeneidade da NSC descendência, baixa produção de neurónios e oligodendrócitos, e uma predominância de astrócitos seguintes diferenciação limitar as suas aplicações clínicas. Aqui, descrevemos uma nova metodologia para a purificação e posterior geração de neurônios imaturos da descendência NSC murino usando separação de células activadas por fluorescência (FACS) da tecnologia. Utilizando esta metodologia, uma população altamente enriquecida de células neuronais progenitoras pode ser conseguida witHout qualquer astrócitos perceptível e bona fide contaminação NSC. O procedimento inclui a diferenciação de NSC progenitura isoladas e expandidas a partir de E14 eminências rato ganglionares utilizando o ensaio neuroesfera, seguido por isolamento e enriquecimento de células neuronais imaturos com base nas suas propriedades físicas (tamanho e complexidade interna) e fluorescente utilizando a tecnologia de citometria de fluxo. Em geral, leva-se 5-7 dias para gerar neuroesferas e 6-8 dias para diferenciar progenitura NSC e isolar altamente purificada imaturos células neuronais.
Protocolo
1. Configuração básica antes de prosseguir para Cultura Celular
- NeuroCult Médio NSC basal e Suplementos NeuroCult NSC proliferação, são misturados a uma proporção de 9:1, respectivamente, para fazer médio NSC completa.
- A 37 ° C banho de água é usada para aquecer o meio.
- Quantidade apropriada de inactivado pelo calor soro fetal de vitelo (FCS) é descongelado.
- Quantidade apropriada de soluções de reserva do factor de crescimento incluindo o factor de crescimento epidérmico (EGF a 10 ug / ml), factor de crescimento básico de fibroblastos (b-FGF, 10 ug / ml) e 0,2% de solução de heparina em salina tamponada com fosfato (PBS) são d....
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Discussão
A capacidade de isolar populações definidas de células neurais (neurônios, ou seja, astrócitos e oligodendrócitos) pode resolver alguns dos impedimentos associados à aplicação clínica de células-tronco neurais (NSCs). Em primeiro lugar, permite-nos para caracterizar completamente a população inicial de células do doador. Em segundo lugar, nos permite usar um tipo particular de célula ou uma combinação de diferentes tipos de células com um rácio específico, dependendo da natureza ou da fase da doença. Por último, utiliza.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi suportado pelo financiamento da Fundação Overstreet.
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Materiais
| Nome do reagente | Tipo | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| NeuroCult Médio NSC Basal | Médio | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Suplementos Proliferação | Suplemento de meio | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| 0,05% de tripsina-EDTA | Reagente | Gibco | 25300-062 | |
| Inibidor de tripsina de soja | Reagente | Sigma | T6522 | |
| Pen / Strep | Reagente | Gibco | 15140-122 | |
| * MEM | Reagente | Gibco | 41500-018 | Componente HEM |
| * Os HEPES | Reagente | Sigma | H4034 | Componente HEM |
| * A água destilada | Reagente | Gibco | 15230-147 | |
| Coador celular | Peneira | BD Falcon | 352340 | |
| T25 balão | Cultura louça | Nalge Nunc internacional | 136196 | |
| T80 balão | Cultura louça | Nalge Nunc internacional | 178905 | |
| 15 ml tubos | Cultura louça | BD Falcon | 352096 | |
| Tubos de 50 ml | Cultura louça | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Fator de crescimento | R & D | 2028-EG | |
| b-FGF | Fator de crescimento | R & D | 3139-FB | |
| Heparina | Fator de crescimento | Sigma | H4784 | Reconstituído em PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Anticorpo | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE-conjugado IgG1 rato | Isotipo de anticorpo de controlo | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparina | Fator de crescimento | Sigma | H4784 | Reconstituído em PBS |
| HrBMP-4 | Fator de crescimento | R & D | 314-BP-010 | |
| Poli-L-Ornithine | Reagente | Sigma | P4957 | |
| Soro fetal de vitelo | Suplemento Médio | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Anticorpo | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulina | Anticorpo | Promega | G7121 |
* Para fazer HEM, mistura 1 x pacote L 10 de MEM e 160 ml de HEPES 1M e levar o volume a 8,75 L com água destilada. Ajuste o pH final para 7,4 e armazená-lo a 4 ° C.
Referências
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393(2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse....
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Reimpressões e permissões
