Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com doença hematológica maligna usando fluxo lateral Tecnologia

Summary

A rápida e precisa de teste ponto-of-care para a aspergilose pulmonar invasiva é apresentado. Leva vantagem de fluxo lateral-tecnologia, utilizando um anticorpo monoclonal específico que se liga a um Aspergillus secretado durante infecções pulmonares. O ensaio é compatível com soro e lavado brochoalveolar e representa um teste adjuvante novo para o diagnóstico da doença.

Abstract

A aspergilose pulmonar invasiva (IPA) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes com doença hematológica maligna e tronco hematopoéticas receptores de transplantes de células ^1. Detecção de IPA representa um desafio formidável de diagnóstico e, na ausência de um 'padrão de ouro', depende de uma combinação de dados clínicos e de microbiologia e histopatologia sempre que possível. Diagnóstico do IPA devem estar de acordo com a Organização Européia para Pesquisa e Tratamento do Câncer e do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas Grupo de Estudos de Micologia consenso (EORTC / MSG) definir "comprovada", "provável", e "possível" doenças invasivas por fungos ² . Actualmente, não à base de ácido nucleico testes foram externamente validado para a detecção de IPA e para que a reacção em cadeia da polimerase (PCR) não está incluído nos actuais critérios da EORTC / MSG de diagnóstico.

Identificação de Aspergillus em cortes histológicos é problemática devido à semedades nas morfologias das hifas com outras invasoras fungos ^3, e identificação comprovada exige o isolamento do agente etiológico em cultura pura. Cultura abordagens dependem da disponibilidade de amostras de biópsia, mas estes nem sempre são acessíveis em pacientes doentes, e nem sempre produzir propágulos viáveis ​​para a cultura quando obtido.

Uma característica importante na patogênese de Aspergillus é angio-invasão, uma característica que proporciona oportunidades para controlar o fungo imunologicamente por meio de testes que detectam assinaturas moléculas antigénicas características no soro e lavado broncoalveolar (LBA) líquidos. Isto conduziu ao desenvolvimento do ensaio imunoenzimático Platelia (GM-EIA) que detecta Aspergillus galactomanano e um 'pan-fúngica' ensaio (ensaio Fungitell) que detecta o componente da parede celular conservada fúngica (1 → 3)-β-D- glucano, mas não nas Mucorales que não possuem este componente em suas paredes celulares ^1,4. Éprocessa em torno da precisão destes testes ^1,4-6 levou ao desenvolvimento recente da próxima geração de anticorpo monoclonal (MAb)-ensaios baseados que detectam marcadores substitutos da infecção ^1,5.

Thornton ⁵ recentemente descrita a geração de um MAb Aspergillus-específico (JF5) usando hibridoma tecnologia ea sua utilização para desenvolver um imuno-cromatografia dispositivo de fluxo lateral (LFD) para o ponto-de-cuidado (POC) diagnóstico de IPA. Uma grande vantagem do LFD é a sua capacidade para detectar a actividade desde MAb JF5 se liga a um antigénio glicoproteina extracelular que é secretado durante o crescimento do fungo activo apenas ^5. Esta é uma consideração importante quando se utiliza fluidos tais como BAL pulmão para o diagnóstico de IPA desde esporos de Aspergillus são um componente comum de ar inalado. A utilidade do dispositivo para o diagnóstico de IPA foi demonstrada utilizando um modelo animal de infecção, em que o LFD exibido sensibilidade melhorada e specificity em comparação com o GM Platelia e Fungitell (1 → 3)-glucano β-D-ensaios ^7.

Aqui, apresentamos um procedimento simples LFD para detectar o antígeno Aspergillus em humanos soro e fluidos BAL. Sua velocidade e precisão fornece um romance adjunto teste point-of-care para diagnóstico do IPA em pacientes com doença hematológica maligna.

Protocol

1. Recolha, Armazenamento e Preparação de soro e fluidos de lavagem broncoalveolar

1. Recolher o soro de amostras de sangue não tratados, permitindo que o sangue coagular a 4 ° C, e soro de armazenamento, conforme alíquotas a -20 ° C antes de usar. Fluidos lavado broncoalveolar (BAL) deve também ser armazenados como alíquotas a -20 ° C. Nota: Armazenamento de soro e LBA como alíquotas limita o potencial de degradação do antigénio alvo por repetidos de congelamento-descongelamento das amostras durante a repetição do teste.
2. As amostras descongelamento e misturar o amostras de soro e BAL completamente por vórtice e centrifugação durante 1 min a 14.000 rpm.
3. Para os testes de rotina de amostras de soro humano, diluir a 1:01 de soro (v / v) com meio de cultura de tecidos (TCM). TCM consiste em meio RPMI-1640, 10% (v / v) de soro de vitelo fetal, 1% (v / v) de solução de L-glutamina 200mM, e azida de sódio (0,02% w / v) como conservante. O meio é preparado antecipadamente e podem ser armazenadas a 4 ° C durante vários meses. Aplicar 100 uL da diluted soro para o LFD.
4. Para humanos fluidos BAL, e para fluidos BAL de modelos animais, aplicam-se 100 uL de amostra pura para o LFD, sem pré-tratamento.
5. Para soro a partir de modelos animais, diluir soro 1:2 (v / v) com tampão fosfato salino contendo 4% (w / v) de EDTA, o calor para 3min num banho de água a ferver, de centrifugação durante 5 min a 14.000 rpm, e aplicar 100 ul de sobrenadante limpo para o dispositivo de LFD.

2. Aplicação de Soro e BAL para o dispositivo de fluxo lateral-

1. Armazenar os dispositivos de fluxo lateral, à temperatura ambiente (23 ° C). A esta temperatura, os dispositivos são estáveis ​​durante 12 meses. Remova os dispositivos de suas bolsas e coloque sobre uma superfície plana.
2. Usando uma ponta de pipeta estéril, aplicar 100 uL de pré-tratado amostra de soro ou puro BAL para a porta de libertação do dispositivo.
3. Permitir que o ensaio para executar durante 15 min à temperatura ambiente, momento em que os resultados dos testes devem ser registados. Nota: No segundo o fluido vai ser sien migrar por acção capilar ao longo da membrana de nitrocelulose na janela de observação.

3. Gravação e Interpretação dos Resultados LFD

1. O LFD consiste de uma linha de controlo interno (indicado pela letra C na caixa de plástico) e uma linha de teste (indicado pela letra T). A linha de controlo deve aparecer sempre independentemente do antigénio Aspergillus na amostra de soro ou BAL. Isso mostra que o ensaio foi executado corretamente.
2. Se o antigénio Aspergillus está presente na amostra de soro ou BAL, a linha de teste também aparece dentro 15min de aplicação da amostra. Devido à intensidade da linha de teste é proporcional à quantidade de Aspergillus presente antigénio na amostra, a linha de teste pode aparecer como um positivo fraco (+), um positivo moderado (+ +) ou como uma forte positivo (+ + +) . No entanto, qualquer linha de teste positivo, independentemente da intensidade, que indicam a presença de Aspergillus antigénio na amostra. Em diaausência de antigénio e Aspergillus, nenhuma linha de teste irá aparecer, eo resultado é registado como negativo (-).

4. Os resultados representativos

Os exemplos representativos de negativas, fracamente positivo, moderada positivos, e forte positivos LFD com amostras de BAL e soro são mostrados na Figura 1.

Resultados de testes positivos de antígeno-LFD (fraca e forte) ou negativo testes LFD utilizando fluidos de BAL de leucemia mielóide aguda (LMA) dos pacientes diagnosticados de acordo com critérios da EORTC / MSG de diagnóstico são mostrados na Tabela 1. Incluem-se nesta tabela são os correspondentes clínicos e micológicos (galactomanano e cultura) de dados e resultados de um teste de PCR Aspergillus específico desenvolvido no Hospital St. Bartholomews ^8, para cada paciente. O diagnóstico da doença foi baseada em fatores do hospedeiro (neutropenia, uso prolongado de corticosteróides, o tratamento com outros reconhecidos de células T immunosuppressants), os critérios clínicos e GM positividade para BAL (aqui definida como um índice GM> 0,8 valor). Sob os 2002 EORTC / MSG ¹⁰ diretrizes, os pacientes 12, 13 e 16 foram diagnosticados com IA "possível" com base em fatores do hospedeiro e os critérios clínicos ou positividade GM. De acordo com a revista (2008) EORTC / MSG diretrizes ^2, fatores do hospedeiro e positividade GM isoladamente ou fatores do hospedeiro e os critérios clínicos si só, não indicam "possível" infecção fúngica invasiva, a menos que acompanhado de prova a partir de dados clínicos e micológicos, respectivamente. Paciente 6 foi diagnosticada com IA "provável" em ambos os 2002 e 2008, porque as orientações de fatores do hospedeiro, maiores e menores características clínicas e positividade GM. Note, que, embora nem o LFD nem PCR estão incluídas nas diretrizes do EORTC / MSG, há um consenso forte entre os dois ensaios eo teste de galactomanano comercial indicando a presença de Aspergillus antígeno e ácido nucléico na amostra BAL s de pacientes 6 e 12. Resultados adicionais de ensaios que demonstram a eficácia dos ensaios LFD e PCR no diagnóstico IPA podem ser encontrados em Johnson et al ^8.

Figura 1. Negativo (linha de controlo apenas) e positivo (de controlo e da linha de teste) os resultados dos testes LFD usando soro e BAL. As intensidades das reacções da linha de teste são proporcionais às concentrações do antigénio alvo nas amostras de soro e BAL. Reacções tipicamente variar de fraco (+) através moderada (+ +) a forte (+ + +). Independentemente da intensidade da linha de teste, todos os três séricos reacções positivas indicaria doença aspergilose invasiva pulmonar devido à presença de circulação de antigénio Aspergillus na corrente sanguínea. Positivos reacções BAL (fraco, moderado ou forte) indicaria a germinação de esporos e desenvolvimento de hifas potencialmente patogénicos nos pulmões.

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Nenhum paciente.	Patiinformações ent	Os critérios clínicos 1	LBA cultura 2	GM EIA índice 3	EORTC / MSG (2002) 4	EORTC / MSG (2008) 5	Aspergillus resultado da PCR	Resultado LFD
6	-	Principais sinais de TC (nódulo e halo) e um menor	Negativo	0,9 (positivo)	Provável	Provável	Positivo	Fracamente positivo (+)
12	Presume infecção fúngica anterior	Não maior, uma menor	Candida glabrata	6,43 (positivo forte)	Possível	Nenhum	Positivo	Strong positivo (+ + +)
13	Staph coagulase-negativoylococcus e E. coli no sangue	Não maior, menor dois	Negativo	0,25 (negativo)	Possível	Nenhum	Negativo	Negativo (-)
16	Infecção no peito	3 critérios menores, incluindo derrame plural novo infiltrado mais	Negativo	0,16 (negativo)	Possível	Nenhum	Negativo	Negativo (-)

¹ Nódulos ou halos em uma tomografia computadorizada é sugestivo de infecção fúngica
² Cândida glabrata no fluido BAL seria considerado como um contaminante como é o segundo de levedura mais comum isolado como parte de flora normal humanos ^9
3 Um índice de> 0,8 no teste de EIA GM do LBA é indicativo de infecção por Aspergillus
⁴ Com base nas 2002 EORTC / MSG critérios diagnósticos para 'pose ',' provável 'ou' comprovada 'doença fúngica ^10
5 Com base na revista (2008) EORTC / MSG critérios diagnósticos para 'possível', 'provável' ou 'comprovada' doença fúngica ²

Tabela 1. Resultados dos testes de LFD de amostras de LBA de pacientes com leucemia mielóide aguda com provável IPA e controle de pacientes com LMA (sem evidência de infecção), e EORTC / MSG diagnóstico de infecção.

Discussion

A identificação definitiva do IPA só pode verdadeiramente ser alcançado pelo isolamento do agente etiológico a partir de amostras de biópsia, mas a recuperação de amostras adequadas muitas vezes não é possível em pacientes muito doentes e Aspergillus é raramente recuperável a partir de sangue. Enquanto grandes avanços foram feitos no uso de tomografia computadorizada de varredura do peito no diagnóstico IPA, características que são sugestivos do IPA pulmonar, como o "halo" ou "ar crescentes" sinais são ou transitória ou pode ser atribuído a artefatos respiratórios ou outras infecções fúngicas ^11,12. Tais dados são, portanto, suplementado com técnicas serológicas que visam identificar moléculas de assinatura (GM e β-glucano) a partir de fungos que são em circulação no soro do paciente ou que estão presentes nos fluidos BAL, expectoração ou amostras de urina ^13. Embora estes testes exibir sensibilidade satisfatória, falta-lhes a especificidade suficiente ou se sofre de interferência sob certas condições ^1,6 .

O teste para a detecção LFD IPA aqui apresentado permite o diagnóstico o «ponto-de-cuidado 'de IPA e exploits tecnologia que tem sido utilizada até à data em testes para a detecção de vírus, bactérias, parasitas e toxinas ^14-19 e, mais notoriamente, para a gravidez em casa testa introduzido pela primeira vez por Unipath em 1988. No LFD Aspergillus descrito aqui, o Aspergillus específico MAb JF5 é imobilizado a uma zona de captação (a linha de teste) em uma membrana de nitrocelulose poroso. Imunoglobulina anti-rato imobilizado para a membrana numa zona separada serviu como um controlo interno (linha de controlo). Por adição de soro ou fluido BAL para a porta de libertação, o MAb conjugado de ouro coloidal JF5-no bloco de libertação se liga ao antigénio alvo e do complexo, em seguida, passa ao longo da membrana porosa por acção capilar. MAb JF5 imobilizado na zona de captura liga-se ao JF5-coloidal complexo ouro-antigénio, resultando em uma linha de teste vermelho. Qualquer desacoplado ouro coloidal-JF5conjugado liga-se ao controlo interno, indicando que o ensaio foi executado correctamente. Isso resulta em uma linha de controle vermelho.

O teste é rápido, tendo apenas 15 minutos para realizar, é barata em comparação com os testes de soro e BAL baseado em GM e β-glucano de detecção, e não requer equipamentos caros ou instalações laboratoriais extensas para ser executado. Além disso, o MAb JF5 não reagem de forma cruzada com as drogas ou contaminantes que foram mostrados para causar falso-positivo de reacção na GM e β-glucano testes ^1,4,6. Uma vantagem adicional importante sobre os actuais testes de diagnóstico é a capacidade para detectar a actividade LFDs que é indicativo de crescimento invasivo de espécies de Aspergillus.

Um passo essencial no processo de LFD é a necessidade de ler os resultados 15 minutos após a aplicação da amostra de soro ou LBA para o dispositivo. O teste não deve ser deixada para mais de 15 min antes de gravar os resultados, como este viés de resultado pode interpretatipor diante. A fraca reação não será reforçada mediante o alargamento do período de incubação. O tratamento térmico de soro a partir de modelos animais de infecção foi encontrada para melhorar a sensibilidade do ensaio. Uma limitação do teste é que ele é qualitativa, e conta com o operador para fazer uma avaliação subjetiva de positividade. A intensidade da linha de teste varia de acordo com o conteúdo de antigénios das amostras de soro e BAL (Figura 1). No entanto, qualquer reacção positiva (determinada por comparação com negativos conhecidos) indica a presença de Aspergillus antigénio e, por conseguinte, a infecção. Para limitar a subjetividade de ensaios LFD, dispositivos portáteis estão disponíveis, que possibilita a quantificação das intensidades de linhas LFD teste e permitir o estabelecimento de limiares para a detecção de antígenos ^20.

Desenvolvimentos futuros do LFD incluem a sua comercialização e no desenvolvimento de um LFD multiplex, que permite a detecção simultânea de outros agentes patogénicos fúngicos invasivasutilizando os AcM altamente específicos ^3.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Aspergillus LFD	Universidade de Exeter		Disponível a partir do autor correspondente, mediante pedido
RPMI-1640	Sigma	R0883
L-Glutamina	Sigma	G7513
Soro fetal de vitelo	Biosera	S9100	Outras fontes de soro de vitela fetal pode ser usado na preparação de TCM
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1