O presente estudo descreve uma abordagem diferenciada dirigida em induzir a diferenciação de pâncreas de células estaminais embrionárias humanas. De grande importância é a constatação de que células endoteliais co-cultura maturação media de células-tronco embrionárias humanas derivadas progenitores pâncreas em células que expressam insulina.
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Artigo de método
Células endoteliais em co-cultura Maturação media de células estaminais humanas embrionárias a células pancreáticas produtoras de insulina em uma abordagem diferenciada Direção
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células-tronco embrionárias (ESC) tem duas características principais: eles podem ser propagadas in vitro indefinidamente em um estado indiferenciado e são pluripotentes, tendo assim o potencial de se diferenciar em várias linhagens. Essas propriedades fazem CES extremamente atraente para a terapia baseada em células e aplicações de tratamento regenerativo 1. No entanto, para o seu pleno potencial a ser realizado as células têm de ser diferenciada em fenótipos maduros e funcionais, o que é uma tarefa assustadora. Uma abordagem promissora na indução da diferenciação celular é a de perto imitar o caminho de organogénese na configuração in vitro. Desenvolvimento pancreática é conhecido para ocorrer em fases específicas 2, começando com endoderme, que pode desenvolver em vários órgãos, incluindo fígado e pâncreas. Indução endoderme pode ser conseguido por modulação da via nodal através da adição de Activina A 3 em combinação com vários factores de crescimento de 4-7 in vitro por adição de ciclopamina 8. Maturação pancreática é mediada por vários eventos paralelos, incluindo inibição da sinalização do entalhe; agregação de células progenitoras pancreáticas em 3-dimensionais aglomerados; indução da vascularização; para nomear alguns. De longe o mais bem sucedido na maturação in vitro de células progenitoras derivadas do CES pancreáticas foram alcançados através da inibição da sinalização Notch por DAPT suplementação 9. Embora bem sucedido, isto resulta em baixo rendimento do fenótipo maduro com funcionalidade reduzida. A área menos estudada é o efeito de células endoteliais de sinalização na maturação do pâncreas, que é cada vez mais apreciada como um fator importante que contribui para in-vivo ilhota pancreática maturação 10,11.
O presente estudo explora o efeito de endothelial célula de sinalização na maturação de células progenitoras humanas CES derivados pancreáticas produtoras de insulina em ilhota células semelhantes. Relatamos um multi-estágio protocolo diferenciação dirigida para onde os CES humanos são primeiro induzida no sentido endoderme por Activina A, juntamente com a inibição da via PI3K. Especificação do pâncreas de células endoderme é conseguido através da inibição da sinalização por Sonic hedgehog ciclopamina juntamente com a indução de retinóide por adição de ácido retinóico. A fase final de maturação é induzida pela sinalização celular endotelial conseguido através de uma configuração de co-cultura. Embora várias células endoteliais foram testados na co-cultura, aqui apresentamos os nossos dados com células de rato do coração microvasculares endoteliais (RHMVEC), principalmente para a facilidade de análise.
Protocolo
1. Manutenção de células
- HESC H1 (WiCell) foram mantidos em células estaminais embrionárias humanas qualificados Matrigel poços revestidos com mTeSR1 mídia, com os meios de mudar a cada dia. Os poços foram revestidos por solução diluída de matrigel, preparado por adição de 300 ul de matrigel hESC em 25 ml de DMEM: F12. 1 ml desta solução matrigel foi adicionado a cada poço de uma placa de seis bem, ou 400 ul adicionados a cada poço de uma placa de 12 poços e deixou-se revestimento durante 1 hora à temperatura ambiente. As células foram passadas mecanicamente a uma razão de divisão de 1:4 por raspagem colónias uma vez que eles atingiram entre 1 e 1,5 milíme....
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Discussão
Durante o desenvolvimento de pâncreas, células pancreáticas de diferenciação estão em estreita proximidade com as células endoteliais da aorta, além disso, ilhéus pancreáticos são densamente vascularizado para promover a troca rápida de glicose no sangue e hormonas de ilhéus. Tendo em conta estes factos, não é surpreendente que as células endoteliais desempenham um papel importante no processo de organogénese pancreático. Embora a importância das células endoteliais durante o desenvolvimento pancreática é cada vez mais .......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Reconhecemos o apoio do NIH Innovator Award Nova DP2 116520 e ORAU Ralph Powe Júnior Prêmio Valorização da Faculdade.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Concentrações |
| mTeSR1 (com suplemento) | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| hESC matrigel qualificado | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM: F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Completo) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Suplemento | Invitrogen | 17504044 | |
| Activina A | R & D | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-trans retinóico | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Selenito de sódio | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 ug / ml |
| Transferrina | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 ug / ml |
| EGF | R & D | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparina | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hidrocortisona | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey Nagel | 740955 | |
| ImProm II sistema de transcrição reversa | Promega | A3800 | |
| Brilhante II SYBR Green QPCR mestre mix | Straragene | 600548 | |
| Sox17 IgG de cabra policlonal | Santa Cruz | sc-17.355 | 1/500 |
| PDX1 cabra policlonal IgG | Santa Cruz | sc-14.662 | 1/500 |
| C-Peptide policlonal de coelho | Sinalização celular | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 burro anti-IgG de coelho | Invitrogen | A-21.206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 cabra burro anti-IgG | Invitrogen | A-21.447 | 1/1000 |
Tabela 2. Reagentes e kits.
Referências
- De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A.
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Reimpressões e permissões
