GC baseado em detecção de ácido Aldononitrile Glucosamina e Murâmicos Acetato derivatizados à determinação do resíduo microbiana em solo

Resumo

Nós descrevemos um método para o protocolo de análise de GC-Based dos derivados aldonitrile acetato de glucosamina e ácido murâmico extraído do solo. Para elucidação do mecanismo química, também apresentar uma estratégia para confirmar a estrutura do derivado e os fragmentos de iões formados mediante ionização de electrões.

Resumo

Abordagens quantitativas dos microrganismos que caracterizam são cruciais para uma compreensão mais ampla do estado microbiana e função dentro dos ecossistemas. As estratégias actuais para análise microbiana incluem ambos os tradicionais de laboratório de cultura dependentes de técnicas e aqueles com base em extracção directa e determinação de biomarcadores determinados ^{1, 2.} Poucos entre a diversidade de espécies microbianas que habitam o solo podem ser cultivadas, de modo a cultura dependentes de métodos de introduzir enviesamentos significativos, uma limitação ausente na análise de biomarcadores.

O ácido glucosamina, manosamina, galactosamina e murâmico têm sido bem como medidas de vivos e mortos massa microbiana, desses ácidos a glucosamina (mais abundante) e murâmico (exclusivamente a partir de células bacterianas) são componentes mais importantes nos sistemas de solo ^{3 , 4.} No entanto, a falta de conhecimento sobre a análise restringe a ampla divulgação entre os pares científicos. Entre todas as existing métodos analíticos, derivatização para aldononitrile acetatos seguido por GC-análise baseada surgiu como uma boa opção em relação à melhor forma equilibrar precisão, sensibilidade, simplicidade, boa separação cromatográfica, e estabilidade durante o armazenamento da amostra ^5.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para uma análise confiável e relativamente simples de glucosamina e ácido murâmico do solo após a sua conversão para acetatos aldononitrile. O protocolo é constituída principalmente por quatro etapas: digestão ácida, a purificação da amostra, a derivatização e determinação GC. O procedimento passo-a-passo é modificada de acordo com as publicações ex ^{6, 7.} Além disso, apresentam-se uma estratégia para estruturalmente validar o ião molecular do derivado e fragmentos seus iões formada a partir de ionização de electrões. Foram aplicados GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS e os reagentes isotopicamente rotulados para determinar o peso molecular de aldononitrile acetato de glucosamina derivatizado e murácido âmico; utilizou-se o deslocamento em massa de marcada com isótopos derivados no espectro de iões para investigar fragmentos de iões de cada derivados ^8. Além disso para a elucidação teórica, a validação do ião molecular do derivado e fragmentos seus iões será útil para os investigadores que utilizam δ ¹³ C ou fragmentos de iões destes biomarcadores em estudos biogeoquímicos ^{9, 10.}

Protocolo

1. Preparação de amostras e extração de ácidos

1. Liofilizar amostras de solo após a coleta de campo.
2. Moer e homogeneizar amostras de solo, utilizando um moinho de bolas, moinho de solo, ou um almofariz e um pilão.
3. Pesar amostras de solo (contendo> 0,3 mg de N) para um balão de hidrólise de 25 mL.
4. Adicionar 10 mL de HCl 6M em cada frasco de hidrólise, preencher N gás ₂ nos frascos, e tampa.
5. Hidrolisar a 105 ° C numa incubadora durante 8 horas, utilizando um interruptor temporizador automático.

2. Purificação da amostra

1. Remover os frascos da incubadora; arrefecer à....

Discussão

O método GC apresentou baseado para a análise de aldononitrile ácido murâmico glucosamina e acetato de derivatizado proporciona um método relativamente rápido para quantificar estes açúcares aminados, extraídos do solo. Os derivados são quimicamente estáveis, e pode ser determinada em uma análise. O método não é restrito às amostras de solo, e pode ser simplificada para amostras de solo não-matriz.

A bomba de vácuo usado neste método é construído para ser resistente a ácido. Sugerimos ainda .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Murâmico	Sigma-Aldrich	M2503-25mg
D-cloridrato de (+)-glucosamina	Sigma-Aldrich	G1514-100G
N-metil-D-glucamina	Sigma-Aldrich	M2004-500G
Mio-inositol	Fisher Scientific	A307003G025
Metanol (seco)	Acros Organics	AC326950010
4-dimetilamino-piridina	Acros Organics	AC148270050
Acetato de etilo	VWR International	BJGC100-4
Cloridrato Hydroxlamine	Fisher Scientific	H330-100
Piridina	Fisher Scientific	P368-500
Anidrido acético	Fisher Scientific	A10-100
Diclorometano (cloreto de metileno)	Fisher Scientific	D37-500
Hexano	Fisher Scientific	H303-4
Ácido clorídrico (6M)	Fisher Scientific	S456-4
Cloridrato de hidroxilamina -15 N	Ícone serviços	IN5280
Anidrido acético -2 H (D 6 C 4 O 3)	Acros Organics	AC174670050
D-glucose-U -13 C	Cambridge isótopo laboratório	CLM-1396-1
Ammonium sufate -15 N	Cambridge isótopo laboratório	NLM-713-1
Nome do equipamento	Companhia	Tipo
Rapid-Vap	Labconco	790002
Vacum bomba	KNF Neuberger	D-79112
Frasco de hidrólise	Fisher Scientific	06 423A
Microtubo derivatização	Fisher Scientific	06-100E
GC	Hewlett-Packard	6890
MS	Hewlett-Packard	5972
LC-ESI-TOF-MS	Agilent	Um sistema Agilent 1200 series HPLC acoplado a um LC Agilent / MSD-TOF