Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal

1. Preparação do homogenato de cérebro e detergente solúvel (S2) e insolúvel (P2) As fracções

1. Tomar 100 mg de tecido cerebral humano congelado e adicionar 100 ul de tampão de lise (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% de Nonidet P-40 (NP-40), EDTA a 0,5%, pH 7,4).
2. Homogeneizar em gelo usando um pilão accionado por um motor sem fios, congelá-lo em gelo seco durante 5 minutos e homogeneizar novamente usando um pilão accionado por mãos primeiro e, em seguida, por motor, e adicionam-se 300 ul de tampão de lise ou 800 ul (isto é, quer o 20 % ou 10% de homogenato de cérebro total, respectivamente).
3. Centrifugar a 20% ou 10% de homogenato de cérebro total a 1,000 xg durante 10 min a 4 ° C para recolher o sobrenadante (S1), utilizando uma centrífuga de bancada.
4. Ultracentrífuga S1 10% a 35.000 rpm (100.000 xg) num rotor SW55 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) durante 1 hora a 4 ° C. Transfira os sobrenadantes (S2) que contêm a fracção detergente solúvel para um tubo limpo. Voltar a suspender as pelotas que contêm detergente insolúvelfracção (P2) em 100 ul de tampão e 200 ul da lise para fazer 10 - ou 5-vezes a preparação concentrada.
5. Para PK-digestão, incubar a amostra com as mesmas quantidades de PK a 50 ug / ml a 37 ° C durante 1 h para ambas as fracções de S2 e P2. Adicionar fluoreto de fenilmetilsulfonilo, na concentração final de 5 mM e volumes iguais de tampão de amostra SDS (3% de SDS, EDTA 2 mM, 4% β-mercaptoetanol, 10% de glicerol, Tris 50 mM, pH 6,8) para terminar a digestão PK. Ferver as amostras durante 10 minutos e arrefecer-los à temperatura ambiente durante 5 min. Eles estão prontos para a transferência de Western.

2. Sedimentação velocidade em Gradientes Passo a saca

1. Incubar 450 uL S1 20% com um volume igual de sarcosil a 2% em H ₂ O durante 30 min em gelo.
2. Adicionar 0,5 ml de cada 60%, 30%, 25%, 20%, 15%, e 10% de sacarose para um tubo com uma capacidade de Beckman ml máxima 5.
3. Carregar 0,4 ml de S1 para o topo de passos de gradientes de 10-60% de sacarose.
4. Centrifugar a 48000 rpm (200000 xg, SW55 rotor) durante 1 h, a 4 ° C.
5. Recolher 283 uL de cada fracção do topo do tubo e obter 12 fracções no total.
6. Tomar 20 ul de cada fracção para um novo tubo Eppendorf, adicionar 20 ul de tampão de amostra, e ferver durante 10 min.
7. Amostras frescas para 4 min na capa, centrifugar a 1.000 xg durante 1 min e vortex eles. Coloque as amostras num gel pré-molde.

3. Cromatografia de Exclusão por Tamanho

1. Use Superdex 200 HR (Pharmacia grânulos, Uppsala, Suécia) em um coluna de 1 cm x 30 para determinar o estado oligomérico de moléculas de PrP.
2. Sete marcadores de massa molecular (Sigma, St. Louis, MI), incluindo dextrano azul (2000 kDa), a tiroglobulina (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-amilase (200 kDa), álcool desidrogenase (150 kDa), albumina ( 66 kDa) e anidrase carbónica (29 kDa) são carregados de forma independente nas concentrações recomendadas pela Sigma em 200 uL volumes de amostra.
3. O volume de eluição de azul dextran é usado para determinar o volume de vazios (V ₀ = 8,45 ml) e o volume total _(t = V 24 ml) é fornecido pela instrução de produto. Os volumes de eluição dos picos (V _e) são calculados a partir do cromatograma e retenções fraccionada. K _av, o coeficiente de partição (que define o comportamento da amostra), é calculada usando a seguinte equação: K = _av (V _e - V ₀₎ / (V _t - V _0). A curva de calibração é determinado traçando a _av K dos padrões de proteína contra o log da MW padrões ^8.
4. O peso molecular (MW) de várias espécies de PrP recuperados em diferentes fracções de FPLC é avaliada de acordo com uma curva de calibração gerada com a filtração através de gel de vários padrões.
5. Injectar 200 S1 ul em tampão de lise contendo 1% de sarcosil para a coluna, para cada funcionamento.
6. Cromatografia é realizada num sistema de FPLC (GE Healthcare), a um caudal de 0,25 ml / min e a fracçãos de 0,25 ml cada são recolhidas utilizando um colector de fracções (Amersham Biosciences, RediFrac).
7. Incubar 0,125 ml cada fracção de metanol com 0,5 ml pré-refrigerada a -20 ° C durante 2 horas.
8. Centrifugue as amostras a 13.000 xg durante 30 min a 4 ° C numa microcentrífuga de bancada. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 20 ul de tampão de amostra de SDS, como mencionado acima, a ebulição durante 10 minutos, arrefecer até à temperatura ambiente, carregá-los em um gel pré-molde.

4. Captura de PrP por G5p

1. A molécula G5p (100 mg) (gentilmente fornecido pelos Drs. Geoff Kneale e McGeehan John da Universidade de Portsmouth, Reino Unido) é conjugado com 7 x 10 ⁸ tosilo activado esferas magnéticas, incubando 100 ug e 350 G5p grânulos G5p uL de 1 ml de tampão de fosfato salino (PBS) a 37 ° C durante 20 horas. Atrair G5p-grânulos para a parede lateral de tubos de Eppendorf por força magnética externa e remova toda a solução. Lave as esferas com 1 ml de PBS contendo0,1% de albumina de soro bovino (BSA) por três vezes.
2. Incubar as grânulos G5p conjugados em 1 ml de 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4, contendo 0,1% de BSA a 37 ° C durante 5 h para bloquear a ligação não específica e depois lavar as pérolas em 1 ml de PBS contendo 0,1% de BSA durante três vezes, como mencionado acima. Remover a solução e adicionar 1 ml de PBS nas pérolas. As pérolas G5p preparadas são estáveis ​​durante pelo menos 3 meses a 4 ° C.
3. A captura de PrP pela G5p é realizada por incubação de 100 ul de fracções S1 ou P2 com 60 uL G5p grânulos conjugados (10 ug de proteína / 6 x 10 ⁷ esferas) em 1 ml de tampão de ligação (3% de Tween-20 NP-, 3% 40 em PBS, pH 7,5).
4. Após a incubação com rotação constante durante 3 horas à temperatura ambiente, as pérolas que contêm PrP G5p são atraídos para a parede lateral de tubos de Eppendorf com a força magnética externa, permitindo a fácil remoção de todas as moléculas não ligadas na solução.
5. Após três lavagens em tampão de lavagem (2% de Tween-20 e 2% de NP-40 em PBS, pH 70,5), os grânulos são recolhidos G5p e aquecida a 95 ° C durante 5 min em tampão de amostra SDS (3% de SDS, EDTA 2 mM, glicerol a 10%, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).
6. Depois de se arrefecer as amostras durante 5 min à temperatura ambiente, as amostras são centrifugadas a 1000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Os sobrenadantes são preparados para transferência Western.

5. Western Blotting

1. Carregar amostras fervidas em tampão de amostra de SDS a 15% em Tris-HCl Critério géis pré-moldados (Bio-Rad) a 150 V durante ~ 80 min.
2. As proteínas nos geles são transferidos para PVDF durante 2 horas a 70V.
3. Após o bloqueio das membranas em leite a 5% em Tris-tamponada salina contendo 0,01% de Tween-20 (TBS-T), as membranas são incubadas durante 2 h à temperatura ambiente, com primários 3F4 anticorpo monoclonal ou policlonal (1:40000), 1E4 (1 : 1000), o anti-N ⁸ (1:6.000), ou anti-C ⁸ (1:6.000) para sondar a molécula de PrP.
4. Após a incubação com o conjugado com HRP de ovelha anti-IgG de ratinho a1:3000, ou de burro anti-IgG de coelho de 1:3.000 as bandas de PrP são visualizadas em filme Kodak utilizando ECL Plus, de acordo com o protocolo do fabricante.

6. Resultados representativos

Em comparação com as amostras de CJD esporádica, uma pequena quantidade de iPrP ^C foi detectado na fracção P2 em cérebros normais, embora mais de PrP ^C foi recuperado na fracção S2 (Figura 1). Como indicado anteriormente ^8, contas iPrP por aproximadamente 5-25% de PrP total, incluindo comprimento completo e espécies truncadas no terminal-N.

As análises que utilizam sacarose sedimentação em gradiente escalonado revelou que, enquanto a maior parte da PrP ^C a partir de não-CJD cérebros foram recuperados nas fracções 1-3 de topo, de pequenas quantidades de PrP foram também detectadas nas fracções 9-11 inferiores que normalmente contêm grandes agregados ⁸ (Figura 2).

Uma grande variedade de espécies de PrP ^Sc rangção a partir de monómeros, oligómeros pequenos para agregados maiores foram isolados por filtração em gel no cérebro com doença de Creutzfeldt-Jakob (Figura 3A). No entanto, uma pequena quantidade de agregados maiores com peso molecular maior do que 2000 kDa também foi detectada nas fracções insolúveis de cérebros normais (Figura 3C). Além disso, dímeros e tetrâmeros da PrP ^C não foram apenas detectada nas fracções insolúveis como também em fracções solúveis (Figura 3B e 3C).

Após o tratamento com PK e PNGase, o PrP capturado por G5p foi detectada com o anticorpo 1E4 contra PrP97-105 ^8. Três fragmentos de PK-resistentes núcleo denominado PrP * ^20, * ¹⁹ PrP, e PrP * ⁷ foram detectados, migrando a ~ 20 kDa, ~ 19 kDa e ~ 7 kDa, respectivamente (Figura 4, painel da esquerda). No entanto, nenhum PrP foi detectada quando o anticorpo 1E4 foi pré-incubado com um peptídeo sintético que tem uma sequência de identical ao epitopo 1E4 (Figura 4, painel do meio), o que indica que as bandas detectadas por 1E4 são fragmentos de PrP. Além disso, o anticorpo anti-C revelou dois fragmentos diferentes de PrP que migram em ~ 18 kDa (PrP * ¹⁸⁾ e ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), além de PrP * ²⁰ (Figura 4, painel da direita).

Figura 1. Detecção de iPrP ^C e ^Sc iPrP. Após tratamento com PNGase F a 1/10 do volume total da reacção a 37 ° C durante 1 hora para remover glicanos a partir da proteína, de comprimento completo ou truncada no terminal-N espécie PrP nas fracções solúvel e insolúvel (S2 e P2) isolado por ultracentrifugação em amostras de cérebro de controlo normal (CTL) e de CJD esporádica (SCJD) foram detectados com 3F4 contra PrP106-112 (painel esquerdo), o anti-N contra PrP23-40 (painel do meio), e anti-C contra PrP220-231 (painel direito). Em amostras de CTL, uma pequena quantidade de PrP é detectada em P2, enquanto que uma grande quantidade está presente em S2. Em contraste, mais PrP é detectada em P2 que em S2 em amostras SCJD.

Figura 2. Sedimentação de PrP em passos de gradientes de sacarose. PrP em fracções individuais de 1 a 11 de não-CJD S1 amostras cerebrais foi detectada por transferência Western com 3F4. Embora a maioria de PrP ^C foi detectada nas fracções 1-3 de topo, de pequenas quantidades de PrP foram também observadas em fracções de fundo 9-11. Além disso, o padrão de bandas de PrP de topo e de fundo é diferente: a PrP recuperados nas fracções de topo tem uma banda dominante superior enquanto PrP recuperados nas fracções de fundo tem uma banda inferior dominante. A PK-tratado PrP ^Sc foi carregado como um controlo sobre o lado direito da mancha.

Figura 3. Detecção de oligómeros solúveis e insolúveis PrP ^C. Solúvel e insolúvel PrP ^C a partir de cérebros humanos normais foram separadas por ultracentrifugação e, em seguida, submetido a filtração em gel, respectivamente. Os tamanhos moleculares das fracções individuais foram medidos através da execução de um grupo de marcadores de massa molecular. (A) PrP ^Sc espécies a partir de amostras do cérebro SCJD. Duas populações de espécies foram detectadas PrP: fracções de filtração em gel 49-65 contêm monómeros e oligómeros pequenos, enquanto que as fracções 27-33 contêm grandes agregados. A espécie PrP ^C a partir de fracção solúvel (S2) (B) e a fracção insolúvel (P2) (C) de controlos normais foram detectados. PrP foi sondada com o anticorpo 3F4. Dímeros (fracção 55) e tetrâmeros (fracção 51) de PrP foi detectada não só em P2, mas também em S2 de sampl cérebro normales (B e C). Grandes agregados foram detectadas apenas em P2 de amostras normais (C).

Figura 4. Detecção de vários fragmentos de PK-resistentes iPrP G5p enriquecidas em preparações a partir de cérebros humanos normais. Amostras enriquecidas por G5p foram tratadas com PK e PNGase F antes de Western blotting sondagem com 1E4 (painel esquerdo), 1E4 pré-incubado com um peptídeo sintético que tinha uma sequência idêntica à do epitopo 1E4 (painel do meio), e anti-C ( painel direito). 1E4 detectado três fragmentos PK-PrP resistentes denominado PrP * ^20, * ¹⁹ PrP, e PrP * ⁷ (painel esquerdo). Após o bloqueio de 1E4 com o péptido, não foram detectadas ^res PrP (painel do meio), o que indica que as bandas detectadas com 1E4 são fragmentos de PrP. Anti-C revelou dois fragmentos de adição PK-PrP resistentes denominado PrP * ¹⁸ e PrP-CTF12 /13, para além da PrP * ^20.

Não há conflitos de interesse declarados.