Name: Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda a isolar oligômeros de PrP solúveis e insolúveis em tecido cerebral humano normal usando homogeneização, sedimentação em gradiente de sacarose e cromatografia de exclusão molecular. Este método avança pesquisas em doenças neurodegenerativas.

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O autores são gratos ao cérebro humano e Centro de Recursos da coluna de líquido (Los Angeles, CA) para fornecer amostras normais do cérebro. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01NS062787, a Fundação CJD, biossegurança Aliança, bem como o Centro Universitário de Envelhecimento e Saúde, com o apoio da Fundação McGregor e Fundo discricionário do Presidente (Case Western Reserve University) .

1. Preparação do homogenato de cérebro e detergente solúvel (S2) e insolúvel (P2) As fracções <ol><li> Tomar 100 mg de tecido cerebral humano congelado e adicionar 100 ul de tampão de lise (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% de Nonidet P-40 (NP-40), EDTA a 0,5%, pH 7,4). </li><li> Homogeneizar em gelo usando um pilão accionado por um motor sem fios, congelá-lo em gelo seco durante 5 minutos e homogeneizar novamente usando um pilão accionado por mãos primeiro e, em seguida, por motor, e adicionam-se 300 ul de tampão de lise ou 800 ul (isto é, quer o 20 % ou 10% de homogenato de cérebro total, respectivamente). </li><li> Centrifugar a 20% ou 10% de homogenato de cérebro total a 1,000 xg durante 10 min a 4 ° C para recolher o sobrenadante (S1), utilizando uma centrífuga de bancada. </li><li> Ultracentrífuga S1 10% a 35.000 rpm (100.000 xg) num rotor SW55 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) durante 1 hora a 4 ° C. Transfira os sobrenadantes (S2) que contêm a fracção detergente solúvel para um tubo limpo. Voltar a suspender as pelotas que contêm detergente insolúvelfracção (P2) em 100 ul de tampão e 200 ul da lise para fazer 10 - ou 5-vezes a preparação concentrada. </li><li> Para PK-digestão, incubar a amostra com as mesmas quantidades de PK a 50 ug / ml a 37 ° C durante 1 h para ambas as fracções de S2 e P2. Adicionar fluoreto de fenilmetilsulfonilo, na concentração final de 5 mM e volumes iguais de tampão de amostra SDS (3% de SDS, EDTA 2 mM, 4% β-mercaptoetanol, 10% de glicerol, Tris 50 mM, pH 6,8) para terminar a digestão PK. Ferver as amostras durante 10 minutos e arrefecer-los à temperatura ambiente durante 5 min. Eles estão prontos para a transferência de Western. </li></ol> 2. Sedimentação velocidade em Gradientes Passo a saca <ol><li> Incubar 450 uL S1 20% com um volume igual de sarcosil a 2% em H 2 O durante 30 min em gelo. </li><li> Adicionar 0,5 ml de cada 60%, 30%, 25%, 20%, 15%, e 10% de sacarose para um tubo com uma capacidade de Beckman ml máxima 5. </li><li> Carregar 0,4 ml de S1 para o topo de passos de gradientes de 10-60% de sacarose. </li><li> Centrifugar a 48000 rpm (200000 xg, SW55 rotor) durante 1 h, a 4 ° C. </li><li> Recolher 283 uL de cada fracção do topo do tubo e obter 12 fracções no total. </li><li> Tomar 20 ul de cada fracção para um novo tubo Eppendorf, adicionar 20 ul de tampão de amostra, e ferver durante 10 min. </li><li> Amostras frescas para 4 min na capa, centrifugar a 1.000 xg durante 1 min e vortex eles. Coloque as amostras num gel pré-molde. </li></ol> 3. Cromatografia de Exclusão por Tamanho <ol><li> Use Superdex 200 HR (Pharmacia grânulos, Uppsala, Suécia) em um coluna de 1 cm x 30 para determinar o estado oligomérico de moléculas de PrP. </li><li> Sete marcadores de massa molecular (Sigma, St. Louis, MI), incluindo dextrano azul (2000 kDa), a tiroglobulina (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-amilase (200 kDa), álcool desidrogenase (150 kDa), albumina ( 66 kDa) e anidrase carbónica (29 kDa) são carregados de forma independente nas concentrações recomendadas pela Sigma em 200 uL volumes de amostra. </li><li> O volume de eluição de azul dextran é usado para determinar o volume de vazios (V 0 = 8,45 ml) e o volume total (t = V 24 ml) é fornecido pela instrução de produto. Os volumes de eluição dos picos (V e) são calculados a partir do cromatograma e retenções fraccionada. K av, o coeficiente de partição (que define o comportamento da amostra), é calculada usando a seguinte equação: K = av (V e - V 0) / (V t - V 0). A curva de calibração é determinado traçando a av K dos padrões de proteína contra o log da MW padrões 8. </li><li> O peso molecular (MW) de várias espécies de PrP recuperados em diferentes fracções de FPLC é avaliada de acordo com uma curva de calibração gerada com a filtração através de gel de vários padrões. </li><li> Injectar 200 S1 ul em tampão de lise contendo 1% de sarcosil para a coluna, para cada funcionamento. </li><li> Cromatografia é realizada num sistema de FPLC (GE Healthcare), a um caudal de 0,25 ml / min e a fracçãos de 0,25 ml cada são recolhidas utilizando um colector de fracções (Amersham Biosciences, RediFrac). </li><li> Incubar 0,125 ml cada fracção de metanol com 0,5 ml pré-refrigerada a -20 ° C durante 2 horas. </li><li> Centrifugue as amostras a 13.000 xg durante 30 min a 4 ° C numa microcentrífuga de bancada. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 20 ul de tampão de amostra de SDS, como mencionado acima, a ebulição durante 10 minutos, arrefecer até à temperatura ambiente, carregá-los em um gel pré-molde. </li></ol> 4. Captura de PrP por G5p <ol><li> A molécula G5p (100 mg) (gentilmente fornecido pelos Drs. Geoff Kneale e McGeehan John da Universidade de Portsmouth, Reino Unido) é conjugado com 7 x 10 8 tosilo activado esferas magnéticas, incubando 100 ug e 350 G5p grânulos G5p uL de 1 ml de tampão de fosfato salino (PBS) a 37 ° C durante 20 horas. Atrair G5p-grânulos para a parede lateral de tubos de Eppendorf por força magnética externa e remova toda a solução. Lave as esferas com 1 ml de PBS contendo0,1% de albumina de soro bovino (BSA) por três vezes. </li><li> Incubar as grânulos G5p conjugados em 1 ml de 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4, contendo 0,1% de BSA a 37 ° C durante 5 h para bloquear a ligação não específica e depois lavar as pérolas em 1 ml de PBS contendo 0,1% de BSA durante três vezes, como mencionado acima. Remover a solução e adicionar 1 ml de PBS nas pérolas. As pérolas G5p preparadas são estáveis ​​durante pelo menos 3 meses a 4 ° C. </li><li> A captura de PrP pela G5p é realizada por incubação de 100 ul de fracções S1 ou P2 com 60 uL G5p grânulos conjugados (10 ug de proteína / 6 x 10 7 esferas) em 1 ml de tampão de ligação (3% de Tween-20 NP-, 3% 40 em PBS, pH 7,5). </li><li> Após a incubação com rotação constante durante 3 horas à temperatura ambiente, as pérolas que contêm PrP G5p são atraídos para a parede lateral de tubos de Eppendorf com a força magnética externa, permitindo a fácil remoção de todas as moléculas não ligadas na solução. </li><li> Após três lavagens em tampão de lavagem (2% de Tween-20 e 2% de NP-40 em PBS, pH 70,5), os grânulos são recolhidos G5p e aquecida a 95 ° C durante 5 min em tampão de amostra SDS (3% de SDS, EDTA 2 mM, glicerol a 10%, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8). </li><li> Depois de se arrefecer as amostras durante 5 min à temperatura ambiente, as amostras são centrifugadas a 1000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Os sobrenadantes são preparados para transferência Western. </li></ol> 5. Western Blotting <ol><li> Carregar amostras fervidas em tampão de amostra de SDS a 15% em Tris-HCl Critério géis pré-moldados (Bio-Rad) a 150 V durante ~ 80 min. </li><li> As proteínas nos geles são transferidos para PVDF durante 2 horas a 70V. </li><li> Após o bloqueio das membranas em leite a 5% em Tris-tamponada salina contendo 0,01% de Tween-20 (TBS-T), as membranas são incubadas durante 2 h à temperatura ambiente, com primários 3F4 anticorpo monoclonal ou policlonal (1:40000), 1E4 (1 : 1000), o anti-N 8 (1:6.000), ou anti-C 8 (1:6.000) para sondar a molécula de PrP. </li><li> Após a incubação com o conjugado com HRP de ovelha anti-IgG de ratinho a1:3000, ou de burro anti-IgG de coelho de 1:3.000 as bandas de PrP são visualizadas em filme Kodak utilizando ECL Plus, de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> 6. Resultados representativos Em comparação com as amostras de CJD esporádica, uma pequena quantidade de iPrP C foi detectado na fracção P2 em cérebros normais, embora mais de PrP C foi recuperado na fracção S2 (Figura 1). Como indicado anteriormente 8, contas iPrP por aproximadamente 5-25% de PrP total, incluindo comprimento completo e espécies truncadas no terminal-N. As análises que utilizam sacarose sedimentação em gradiente escalonado revelou que, enquanto a maior parte da PrP C a partir de não-CJD cérebros foram recuperados nas fracções 1-3 de topo, de pequenas quantidades de PrP foram também detectadas nas fracções 9-11 inferiores que normalmente contêm grandes agregados 8 (Figura 2). Uma grande variedade de espécies de PrP Sc rangção a partir de monómeros, oligómeros pequenos para agregados maiores foram isolados por filtração em gel no cérebro com doença de Creutzfeldt-Jakob (Figura 3A). No entanto, uma pequena quantidade de agregados maiores com peso molecular maior do que 2000 kDa também foi detectada nas fracções insolúveis de cérebros normais (Figura 3C). Além disso, dímeros e tetrâmeros da PrP C não foram apenas detectada nas fracções insolúveis como também em fracções solúveis (Figura 3B e 3C). Após o tratamento com PK e PNGase, o PrP capturado por G5p foi detectada com o anticorpo 1E4 contra PrP97-105 8. Três fragmentos de PK-resistentes núcleo denominado PrP * 20, * 19 PrP, e PrP * 7 foram detectados, migrando a ~ 20 kDa, ~ 19 kDa e ~ 7 kDa, respectivamente (Figura 4, painel da esquerda). No entanto, nenhum PrP foi detectada quando o anticorpo 1E4 foi pré-incubado com um peptídeo sintético que tem uma sequência de identical ao epitopo 1E4 (Figura 4, painel do meio), o que indica que as bandas detectadas por 1E4 são fragmentos de PrP. Além disso, o anticorpo anti-C revelou dois fragmentos diferentes de PrP que migram em ~ 18 kDa (PrP * 18) e ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), além de PrP * 20 (Figura 4, painel da direita). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" /> Figura 1. Detecção de iPrP C e Sc iPrP. Após tratamento com PNGase F a 1/10 do volume total da reacção a 37 ° C durante 1 hora para remover glicanos a partir da proteína, de comprimento completo ou truncada no terminal-N espécie PrP nas fracções solúvel e insolúvel (S2 e P2) isolado por ultracentrifugação em amostras de cérebro de controlo normal (CTL) e de CJD esporádica (SCJD) foram detectados com 3F4 contra PrP106-112 (painel esquerdo), o anti-N contra PrP23-40 (painel do meio), e anti-C contra PrP220-231 (painel direito). Em amostras de CTL, uma pequena quantidade de PrP é detectada em P2, enquanto que uma grande quantidade está presente em S2. Em contraste, mais PrP é detectada em P2 que em S2 em amostras SCJD. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" /> Figura 2. Sedimentação de PrP em passos de gradientes de sacarose. PrP em fracções individuais de 1 a 11 de não-CJD S1 amostras cerebrais foi detectada por transferência Western com 3F4. Embora a maioria de PrP C foi detectada nas fracções 1-3 de topo, de pequenas quantidades de PrP foram também observadas em fracções de fundo 9-11. Além disso, o padrão de bandas de PrP de topo e de fundo é diferente: a PrP recuperados nas fracções de topo tem uma banda dominante superior enquanto PrP recuperados nas fracções de fundo tem uma banda inferior dominante. A PK-tratado PrP Sc foi carregado como um controlo sobre o lado direito da mancha. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg /&quot; /&gt; Figura 3. Detecção de oligómeros solúveis e insolúveis PrP C. Solúvel e insolúvel PrP C a partir de cérebros humanos normais foram separadas por ultracentrifugação e, em seguida, submetido a filtração em gel, respectivamente. Os tamanhos moleculares das fracções individuais foram medidos através da execução de um grupo de marcadores de massa molecular. (A) PrP Sc espécies a partir de amostras do cérebro SCJD. Duas populações de espécies foram detectadas PrP: fracções de filtração em gel 49-65 contêm monómeros e oligómeros pequenos, enquanto que as fracções 27-33 contêm grandes agregados. A espécie PrP C a partir de fracção solúvel (S2) (B) e a fracção insolúvel (P2) (C) de controlos normais foram detectados. PrP foi sondada com o anticorpo 3F4. Dímeros (fracção 55) e tetrâmeros (fracção 51) de PrP foi detectada não só em P2, mas também em S2 de sampl cérebro normales (B e C). Grandes agregados foram detectadas apenas em P2 de amostras normais (C). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" /> Figura 4. Detecção de vários fragmentos de PK-resistentes iPrP G5p enriquecidas em preparações a partir de cérebros humanos normais. Amostras enriquecidas por G5p foram tratadas com PK e PNGase F antes de Western blotting sondagem com 1E4 (painel esquerdo), 1E4 pré-incubado com um peptídeo sintético que tinha uma sequência idêntica à do epitopo 1E4 (painel do meio), e anti-C ( painel direito). 1E4 detectado três fragmentos PK-PrP resistentes denominado PrP * 20, * 19 PrP, e PrP * 7 (painel esquerdo). Após o bloqueio de 1E4 com o péptido, não foram detectadas res PrP (painel do meio), o que indica que as bandas detectadas com 1E4 são fragmentos de PrP. Anti-C revelou dois fragmentos de adição PK-PrP resistentes denominado PrP * 18 e PrP-CTF12 /13, para além da PrP * 20.

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions.+Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li>
<li>Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li>
<li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li>
<li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li>
<li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+%28SAF%29+has+the+same+size%2C+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+%28PrP%29%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li>
<li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li>
<li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+prions+lying+in+wait%3A+a+two-hit+model+of+prion%2Famyloid+formation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li>
<li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li>
<li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variably+protease-sensitive+prionopathy%3A+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li>
<li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li>
<li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZou%2C+WQ+%22Methods+in+Molecular+Biology-Neurogenetics%3A+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols</a>. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).</li>
<li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A combinação de abordagens aqui relatado isola consistentemente agregados insolúveis PrP C e PrP C oligómeros solúveis de cérebro humano normal. Ultracentrifugação a 100.000 xg durante uma hora, é um método clássico que tem sido amplamente utilizado para a separação do insolúvel PrPSc solúvel a partir da PrP C 14. Embora seja eficaz, uma das precauções é evitar a contaminação durante o puxar-se o sobrenadante (S2), após a centrifugação. Uma vez que o perfil de gel de iPrP <sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Fluoreto de fenilmetilsulfonilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 mM em 2-propanol </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 mg / ml em H2O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrífuga LE-80K, SW55 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> Peça n º 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 esferas de RH </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC sistema </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Os marcadores de peso molecular </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Variou </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 esferas magnéticas </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo 3F4 </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo 1E4 </td><td> Cell Sciences </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Gel pronto 15% de Tris-HCl géis pré-moldados </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de oligómeros prp solúveis e insolúveis no cérebro humano normal

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

O evento central na patogénese das doenças provocadas por priões envolve a conversão do hospedeiro celular codificado prião proteína PrP C em sua isoforma patogénica PrP Sc 1. PrP C é solúvel em detergente e sensível à proteinase K (PK)-digestão, enquanto que a PrP Sc detergente forma de agregados insolúveis e é parcialmente resistente a PK 2-6. A conversão da PrP C e PrP Sc é conhecida por envolver a transição conformacional de α-helicoidal para β folhas estruturas da proteína. No entanto, o caminho em vivo ainda é pouco compreendida. A tentativa endógena PrPSc, intermediário * PrP ou &quot;prião silenciosa&quot;, ainda tem de ser identificado no cérebro não infectado 7. Usando uma combinação de abordagens biofísicas e bioquímicas, identificamos agregados insolúveis PrP C (designado iPrP C) a partir de cérebros de mamíferos não infectados e em cultura neuronalcélulas 8, 9. Aqui, descrevemos os procedimentos pormenorizados destes métodos, incluindo ultracentrifugação em tampão detergente, a sedimentação em gradiente escalonado de sacarose, cromatografia de exclusão de tamanho, o enriquecimento iPrP pelo gene da proteína 5 (G5p) que se ligam especificamente a formas de PrP estruturalmente alterados 10 e PK-tratamento. A combinação destas abordagens isolados não apenas insolúvel PrP Sc e agregados PrP C, mas também oligómeros solúveis PrP C a partir do cérebro humano normal. Uma vez que os protocolos aqui descritos foram utilizados para isolar tanto PrPSc de cérebros infectados e C iPrP de cérebros de não infectados, eles dão-nos a oportunidade de comparar as diferenças nas características físico-químicas, neurotoxicidade e infectividade entre as duas isoformas. Tal estudo vai melhorar muito a nossa compreensão dos agentes infecciosos proteicas. A fisiologia e fisiopatologia do iPrP C não são claras no presente. Notavelmente, em recém-iddoença de príon entified humano denominado variável protease-sensível prionopathy, encontramos um novo PrPSc que compartilha o comportamento imunorreativos e fragmentação com iPrP C 11, 12. Além disso, foi recentemente demonstrado que iPrP C é a espécie principal, que interage com a proteína amilóide-β na doença de Alzheimer 13. No mesmo estudo, estes métodos foram usados ​​para isolar os agregados Abeta e oligómeros em doença de Alzheimer, 13, o que sugere a sua aplicação aos agregados de proteína prião não envolvidos em outras doenças neurodegenerativas.

Uma nova espécie de proteína príon celular (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) Foi recentemente identificada em cérebros humanos não infectadas com os métodos descritos aqui. Estes métodos podem ser utilizados para isolar espécies diferentes de PrP, enquanto alguns deles são também úteis no isolamento de outros agregados de proteínas mal dobradas a partir de cérebros humanos.

Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal

O evento central na patogênese das doenças priônicas envolve a conversão da proteína priônica celular codificada pelo hospedeiro, PrPC, em sua isoforma patogênica...

O objetivo deste procedimento é isolar a proteína pion solúvel e insolúvel ou PRP em todos os ligamentos do cérebro humano normal. Isso é realizado primeiramente homogeneizando o tecido cerebral humano e isolando as frações. Em seguida, é realizada a sedimentação por velocidade em gradientes de sacarose em etapas.Em seguida, realiza-se a cromatografia de exclusão por tamanho. Finalmente, o PRP é capturado com a proteína do gene cinco ou G cinco P. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o isolamento de PRP solúvel e insolúvel ou ligamentos a partir do cérebro humano normal por meio de ultracentrifugação em gradientes de sacarose, cromatografia de exclusão por tamanho e captura do PRP com G cinco P. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na pesquisa de doenças priônicas, incluindo a doença de Creutzfeldt-Jakob, encefalopatia espongiforme bovina e doenças clínicas de desgaste. Além disso, podem fornecer subsídios para o isolamento de proteínas priônicas solúveis e insolúveis, não apenas para doenças priônicas, mas também para outras doenças, como a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson.Em geral, indivíduos novos nestes métodos terão di

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Medicine

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Este vídeo demonstra o protocolo para isolar fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral de camundongo usando centrifugação por gradiente de densidade e digestão de proteínas não amilóides.

Isolamento de fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral

Este vídeo explica o processo de isolamento e enriquecimento de agregados de proteínas insolúveis em detergente do tecido cerebral humano post-mortem congelado. Ele demonstra as principais etapas, incluindo homogeneização, tratamento com detergente, sonicação e ultracentrifugação para separar e purificar os agregados insolúveis. A etapa final envolve a solubilização dos agregados em tampão de ureia para análise posterior.

Isolamento de agregados de proteínas insolúveis em detergente do tecido cerebral humano post-mortem

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Descrevemos um protocolo que permite a purificação do compartimento vascular do cérebro do camundongo. Os vasos cerebrais isolados incluem células endoteliais ligadas por junções apertadas e cercadas por uma lâmina basal contínua, pericitos, células musculares lisas vasculares, bem como membranas astrogliais perivasculares.

Purificação de embarcações do cérebro do rato

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez mais insolúvel/agregada do tecido cerebral humano post-mortem. Através da utilização de tampões com aumento da força do detergente e técnicas de ultracentrifugação de alta velocidade, as propriedades variáveis da agregação de α-syn em tecidos doentes e não doentes podem ser examinadas.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

Aqui, apresentamos um protocolo de fracionamento de membrana cerebral que representa um procedimento robusto para isolar proteínas pertencentes a diferentes compartimentos sinápticos.

Fracionamento de Membranas Cerebrais: Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem para Avaliar a Localização de Proteínas Subinápticas

Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Aqui, um método para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana é descrito. Este protocolo tem a clara vantagem de produzir microvessel enriquecido amostras com proteína aceitável de rendimento de animais individuais. Amostras podem ser usadas para as análises de proteína robusto no endotélio microvascular cerebral.

Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de Microvessels de cérebro de rato recém isoladas

Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.

Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro

Aprenda a isolar oligômeros de PrP solúveis e insolúveis em tecido cerebral humano normal usando homogeneização, sedimentação em gradiente de sacarose e cromatografia de exclusão molecular. Este método avança pesquisas em doenças neurodegenerativas.

Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal

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