Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal

O objetivo deste procedimento é isolar a proteína pion solúvel e insolúvel ou PRP em todos os ligamentos do cérebro humano normal. Isso é realizado primeiramente homogeneizando o tecido cerebral humano e isolando as frações. Em seguida, é realizada a sedimentação por velocidade em gradientes de sacarose em etapas.

Em seguida, realiza-se a cromatografia de exclusão por tamanho. Finalmente, o PRP é capturado com a proteína do gene cinco ou G cinco P. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o isolamento de PRP solúvel e insolúvel ou ligamentos a partir do cérebro humano normal por meio de ultracentrifugação em gradientes de sacarose, cromatografia de exclusão por tamanho e captura do PRP com G cinco P. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na pesquisa de doenças priônicas, incluindo a doença de Creutzfeldt-Jakob, encefalopatia espongiforme bovina e doenças clínicas de desgaste. Além disso, podem fornecer subsídios para o isolamento de proteínas priônicas solúveis e insolúveis, não apenas para doenças priônicas, mas também para outras doenças, como a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson.

Em geral, indivíduos novos nestes métodos terão dificuldades, pois todas as etapas experimentais são importantes e exigem cuidado adicional. A demonstração em vídeo desta técnica é essencial, já que a SEC Fi possui grande profundidade e a captura de PRP com G cinco P são etapas difíceis de descrever e podem ser imprecisas sem uma operação mais cuidadosa. Para preparar um homogeneizado cerebral, comece adicionando 100 microlitros de tampão de lise a 100 miligramas de tecido cerebral congelado usando um pistilo motorizado, homogeneíze o tecido em gelo, congele em gelo seco por cinco minutos e homogeneíze novamente.

Prepare um homogeneizado total de cérebro a 20% ou 10% adicionando respectivamente 300 ou 800 microlitros de tampão de lise. Usando uma centrífuga de bancada, centrifugue o homogeneizado a 1000 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Colete a SNA em um rotor S SW 55 e centrifugue a fração S1 a 35.000 RPM durante uma hora a quatro graus Celsius.

Transfira o sobrenadante para um tubo limpo de ressuspensão. Suspenda o pellet insolúvel em detergente no tampão de lise para preparar as amostras para o western blot. Incube as frações S2 e P2 com 50 microgramas por mililitro de proteinase K por uma hora a 37 graus Celsius.

Interrompa a digestão adicionando PMSF a cinco milimolar e tampão amostral de SDS. Ferva as amostras por 10 minutos e deixe esfriar à temperatura ambiente por cinco minutos. Para realizar a sedimentação por velocidade, comece incubando 450 microlitros da fração S um 20% com volume igual de água 2% Sarco X em gelo durante 30 minutos em tubos de centrífuga de cinco mililitros. Adicione 0,5 mililitros de cada solução de sacarose a 60, 30, 25, 20, 15 e 10%, e carregue 0,4 mililitros do S um incubado no topo do gradiente de sacarose de 10 a 60%.

Centrifugue gradientes em etapas em rotor SW 55 a 48.000 RPM por uma hora a quatro graus Celsius a partir do topo do tubo. Colete 12 frações iguais de 283 microlitros cada. Utilize 20 microlitros de cada fração e volume igual de tampão amostral SDS.

Para preparar as amostras de gel de SDS-PAGE. Ferva as amostras por 10 minutos, depois resfrie-as por quatro minutos. Centrifugue as amostras a 1000 ×g por um minuto.

Em seguida, vortexe-os antes de carregá-los em um gel predefinido de exclusão por tamanho. A cromatografia é utilizada para determinar o estado oligomérico das moléculas de PRP. Comece carregando volumes de amostra de 200 microlitros de sete marcadores individuais de massa molecular em uma coluna de 1 por 30 de perlas SUEx 200 HR.

Utilize o volume eluído de dextrana azul como volume de exclusão. Calcule os volumes eluídos de pico de VE a partir do cromatograma e das retenções fracionais. Calcule o coeficiente de partição KAV utilizando a equação KAV igual a V menos V zero sobre VT menos V zero.

Para gerar uma curva de calibração, plote o KAV dos padrões proteicos contra o log do peso molecular dos padrões. Em seguida, aplique 200 microlitros de S um na coluna a uma taxa de fluxo de 0,25 mililitros por minuto.

Lave a coluna com tampão de lise 1% cile e, utilizando um coletor de frações, elua frações de 0,25 mililitro. Incube 125 microlitros de cada fração com 500 microlitros de metanol pré-resfriado a menos 20 graus Celsius por duas horas. Centrifugue as amostras a 13.000 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Reese, ressuspenda o pellet em 20 microlitros de tampão amostral SDS e ferva por 10 minutos. Deixe esfriar até a temperatura ambiente e separe em géis de poliacrilamida a 15%. Utilize a curva padrão para extrapolar os pesos moleculares das várias espécies de PRP recuperadas para conjugação da molécula G cinco P às microesferas magnéticas.

Incube 100 microgramas de G cinco P com 350 microlitros de microesferas magnéticas ativadas com toci em um mililitro de PBS a 37 graus Celsius por 20 horas. Utilize um ímã externo para atrair as microesferas de G cinco P para a parede lateral dos tubos eppendorf e remova a solução. Lave as microesferas três vezes com um mililitro de PBS 0,1% BSA para bloquear a ligação não específica.

Incube as microesferas conjugadas com G cinco P em um mililitro de tris 0,2 molar, HCL pH 7,4 contendo 0,1% de BSA por cinco horas a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as microesferas três vezes. Remova a última lavagem e adicione um mililitro de PBS para isolar PRP; incube 100 microlitros de S um ou P dois com 60 microlitros de microesferas conjugadas com G cinco B em um mililitro de tampão de ligação sob rotação constante por três horas à temperatura ambiente.

Coloque o tubo no ímã. Remova a solução e lave as microesferas três vezes com tampão de lavagem. Remova a última lavagem e adicione o tampão amostral de SDS.

Aqueça as esferas a 95 graus Celsius por cinco minutos. Carregue as amostras em géis pré-moldados a 15% e execute a 150 volts por cerca de 80, durante 80 minutos. Transfira as proteínas para PVDF a 70 volts por duas horas após bloquear as membranas com leite a 5% em TBST.

Incube-os por duas horas à temperatura ambiente com os anticorpos PRP. Três F quatro um E quatro anti N ou anti C após a incubação com anticorpos secundários conjugados à HRP, incube a membrana e a solução de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante e exponha o filme conforme visto aqui em comparação com amostras esporádicas de doença da válvula CRUT jaakko ou doença de CJD. Uma pequena quantidade de PRP celular insolúvel foi detectada na fração P dois de cérebros normais.

No entanto, a maior parte foi recuperada na fração S2. O PRP insolúvel representa aproximadamente de cinco a 25% do PRP total, incluindo espécies de comprimento completo e truncadas nos terminais. Análises utilizando sedimentação em gradiente de sacarose em degraus revelaram que, embora a maior parte do PRPC proveniente de cérebros não afetados pela DCE fosse recuperada nas frações superiores, pequenas quantidades de PRP também foram detectadas nas frações inferiores (nove a 11), que normalmente contêm grandes agregados. Uma variedade de espécies patogênicas de PRP ou PRP-SC, variando desde monômeros,

Ligamentos menores e agregados maiores foram isolados por filtração em gel no cérebro com doença yakup da válvula CRUT. Surpreendentemente, uma pequena quantidade de agregados maiores com massa molecular superior a 2000 quilodaltons também foi detectada em frações insolúveis de cérebros normais. Além disso, dímeros e tetrâmeros de PRPC não foram detectados apenas em frações insolúveis, mas também em frações insolúveis.

Após o tratamento com PK e P NGAs. O PRP capturado por G cinco P foi detectado com o anticorpo um E quatro contra PRP 97 1 0 5 3. Fragmentos centrais resistentes à PK, denominados PRP asterisco 20, PRP asterisco 19 e PRP asterisco sete, foram detectados migrando em 20 kilodaltons, 19 kilodaltons e 7 kilodaltons, respectivamente.

No entanto, nenhuma PRP foi detectada quando o anticorpo one E four foi pré-incubado com um peptídeo sintético que possui uma sequência idêntica ao epítopo one E four, indicando que as bandas detectadas pelo one E four são fragmentos de PRP. O anticorpo anti C detectou dois fragmentos diferentes de PRP que migraram em torno de 18 quilodaltons e em torno de 12 a 13 quilodaltons. Além disso, ao método PRP ETE 20 Once.

Essa técnica pode ser realizada em quatro dias se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar as frações solúvel e insolúvel de PRP poligâmico no cérebro humano inferior após o seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisas sobre o destino de PIP, a fim de explorar informações sobre a confirmação de PIP no cérebro.