Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal

O objetivo deste procedimento é isolar a proteína píon solúvel e insolúvel ou PRP todos os ligamentos no cérebro humano normal. Isso é feito primeiro homogeneizando o tecido cerebral humano e isolando as frações. Em seguida, a sedimentação de velocidade em sacarose, gradientes de degrau é realizada.

Em seguida, é realizada cromatografia de exclusão de tamanho. Finalmente, o PRP é capturado com a proteína do gene cinco ou G cinco P. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o isolamento de PRP ou ligamentos solúveis e insolúveis do cérebro humano normal por meio de ultracentrifugação em sacarose, gradientes de etapas, tamanho, cromatografia de exclusão e captura de PRP com G cinco P. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa de pré-doenças, incluindo cria mais doença do chacal, encefalopatia do pontão BO e doenças clínicas debilitantes. Mais eles podem fornecer informações sobre o isolamento de proteínas solúveis e insolúveis, não apenas para doenças iônicas, mas também para outras doenças, como a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson.

Geralmente, os indivíduos novos nesses métodos terão dificuldades porque todas as etapas experimentais são importantes, o que requer cuidado extra. A demonstração em vídeo desta mensagem é crítica, pois o SEC Fi é a grandeza da profundidade e a captura do PRP com G cinco P, essas etapas são difíceis de nomear e podem ser justas sem uma operação mais precisa. Para preparar um homogeneizado cerebral, comece adicionando 100 microlitros de tampão de lise a 100 miligramas de tecido cerebral congelado usando um pilão motorizado, homogeneize o tecido no gelo, congele-o em gelo seco por cinco minutos e homogeneize-o novamente.

Faça um homogeneizado cerebral total de 20% ou 10% adicionando 300 ou 800 microlitros, respectivamente, de tampão de lise. Usando uma centrífuga de bancada, gire o homogeneizado a 1000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Colete o SNA em uma centrífuga de rotor S SW 55 e a fração S uma a 35.000 RPM por uma hora a quatro graus Celsius.

Transfira o supinato para um tubo limpo Resus. Suspenda o pellet insolúvel em detergente em tampão de lise para preparar amostras para western blot. Incubar as fracções S dois e P dois com 50 microgramas por mililitro de proteinase K durante uma hora a 37 graus Celsius.

Termine a digestão adicionando cinco milimolares PMSF e tampão de amostra SDS. Ferva as amostras por 10 minutos e coloque-as em temperatura ambiente por cinco minutos Para realizar a sedimentação por velocidade, comece incubando 450 microlitros da fração 20%S uma com um volume igual de 2%Sarco X água no gelo por 30 minutos para tubos de centrífuga de cinco mililitros. Adicione 0,5 mililitros de 60, 30, 25, 20, 15 e 10% de sacarose, carregue 0,4 mililitros da incubadora S um no topo de 10 a 60% de sacarose.

Os gradientes de degrau centrifugam em um rotor SW 55 a 48.000 RPM por uma hora a quatro graus Celsius a partir do topo do tubo. Colete 12 frações iguais de 283 microlitros cada. Use 20 microlitros de cada fração e um volume igual de tampão de amostra SDS.

Para preparar amostras de gel de página SDS. Ferva as amostras por 10 minutos e depois chame-as por quatro minutos. Centrifugar as amostras a 1000 g durante um minuto.

Em seguida, faça um vórtice antes de carregá-los em uma exclusão de tamanho de gel pré-moldado. A cromatografia é usada para determinar o estado oligomérico das moléculas de PRP. Comece carregando volumes de amostra de 200 microlitros de sete marcadores de massa molecular individuais em uma coluna de um por 30 de grânulos SUEx 200 HR.

Use o volume eluciano do dextrano azul como o volume vazio. Calcular os volumes elucianos máximos de VE a partir do cromatograma e das retenções fraccionadas. Calcule KAV o coeficiente de partição usando a equação KAV é igual a V menos V zero sobre VT menos V zero.

Para gerar uma curva de calibração. Plotar o KAV dos padrões de proteína em relação ao peso molecular logarítmico dos padrões. Em seguida, aplique 200 microlitros de S um na coluna a uma vazão de 0,25 mililitros por minuto.

Lave a coluna com tampão de lise 1% cile e usando um coletor de frações eluir frações de 0,25 mililitro. Incube 125 microlitros de cada fração com 500 microlitros de metanol pré-resfriado a menos 20 graus Celsius por duas horas. Centrifugar as amostras a 13 000 g durante 30 minutos a quatro graus Celsius.

Reese, dobre o pellet em 20 microlitros de tampão de amostra SDS ferva por 10 minutos. Ligue para a temperatura ambiente e resolva em géis de poliacrilamida a 15%. Use a curva padrão para extrapolar os pesos moleculares das várias espécies de PRP recuperadas para conjugar a molécula G cinco P com as esferas magnéticas.

Incubar 100 microgramas de G cinco P com 350 microlitros de contas magnéticas ativadas por toci em um mililitro de PBS a 37 graus Celsius por 20 horas. Use um ímã externo para atrair os grânulos G cinco P para a parede lateral dos tubos eppendorf e remova a solução. Lave as contas três vezes com um mililitro de PBS 0,1% BSA para bloquear a ligação não específica.

Incube as esferas conjugadas G cinco P em um mililitro de 0,2 molo tris, HCL pH 7,4 contendo 0,1% BSA por cinco horas a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as contas três vezes. Remova a última lavagem e adicione um mililitro de PBS para isolar o PRP, incube 100 microlitros de S um ou P dois com 60 microlitros de G, cinco contas conjugadas B em um mililitro de tampão de ligação sob rotação constante por três horas de temperatura ambiente.

Coloque o tubo no ímã. Remova a solução e lave as contas três vezes com tampão de lavagem. Remova a lavagem final e adicione tampão de amostra SDS.

Aqueça as contas a 95 graus Celsius por cinco minutos. Carregue as amostras em géis pré-moldados a 15% e execute a 150 volts por cerca de 80, 80 minutos. Transfira as proteínas para PVDF a 70 volts por duas horas após bloquear as membranas em 5% de leite em TBST.

Incube-os por duas horas em temperatura ambiente com os anticorpos PRP. Três F, quatro, um, E, quatro, anti N ou anti C após incubação com anticorpos secundários conjugados com HRP, incubam a membrana e a solução de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante e expõem o filme como visto aqui em comparação com amostras esporádicas de doença de jaakko da válvula CRUT ou DCJ. Uma pequena quantidade de PRP celular insolúvel foi detectada na fração P dois de cérebros normais.

No entanto, a maior parte foi recuperada na fração S dois. O PRP insolúvel é responsável por aproximadamente cinco a 25% do PRP total, incluindo análises de espécies truncadas terminais de comprimento total e final usando sedimentação de gradiente de sacarose revelou que, embora a maior parte do PRPC de cérebros não CJD tenha sido recuperada nas frações superiores, três pequenas quantidades de PRP também foram detectadas nas frações inferiores nove 11 que normalmente contêm grandes agregados. Uma variedade de espécies patogênicas de PRP ou PRP SC, variando de monômeros.

Ligamentos menores e agregados maiores foram isolados por filtração em gel no cérebro com doença de yakup valvar CRUT. Surpreendentemente, uma pequena quantidade de agregados maiores com um rastro molecular superior a 2000 kilodaltons também foi detectada em frações insolúveis de cérebros normais. Além disso, dímeros e tetrâmeros de PRPC não foram detectados apenas em frações insolúveis, mas também em frações insolúveis.

Após o tratamento com PK e P NGAs. O PRP capturado por G cinco P foi detectado com o anticorpo um E quatro contra PRP 97 1 0 5 3. Fragmentos de núcleo resistentes a PK denominados PRP asterisco 20, PRP asterisco 19 e PRP asterisco sete foram detectados migrando a 20 assassinos Dawsons 19 kilodaltons e sete kilodaltons, respectivamente.

No entanto, nenhum PRP foi detectado quando o anticorpo E quatro foi pré-incubado com um peptídeo sintético que possui uma sequência idêntica ao epítopo E quatro, indicando que as bandas detectadas por um E quatro são fragmentos de PRP. O anticorpo anti C detectou dois fragmentos diferentes de PRP migrando em torno de 18 kilodaltons e cerca de 12 a 13 kilodaltons. Além do método PRP ETE 20 Once.

Esta técnica pode ser feita em quatro dias se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o PRP solúvel e insolúvel polígamo na parte inferior do cérebro humano após o desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisas sobre o destino de antes de explorar as informações de confirmação do PIP no cérebro.