Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Resumo

Mycobacterium tuberculosis forma biofilmes de drogas tolerantes quando cultivadas em certas condições. Aqui descrevemos métodos para cultura de M. biofilmes de tuberculose e que determinam a freqüência de persistentes drogas tolerantes. Estes protocolos serão úteis para estudos posteriores sobre os mecanismos de tolerância à droga em M. tuberculose.

Resumo

Mycobacterium tuberculosis, agente etiológico da tuberculose humana, tem uma capacidade extraordinária para sobreviver contra estresses ambientais, incluindo antibióticos. Embora a tolerância ao estresse de M. tuberculose é um dos provavelmente contribui para a quimioterapia 6-mês longo da tuberculose ^1, os mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo característica do agente patogénico permanecem incertos. Muitas espécies microbianas evoluíram para sobreviver em ambientes estressantes por auto-montagem em superfície altamente organizada, em anexo, e estruturas matriciais encapsulados chamados biofilmes ^2-4. Crescimento em comunidades parece ser uma estratégia de sobrevivência preferida de micróbios, e é conseguida por meio de componentes genéticos que regulam fixação superfície, as comunicações intercelulares, e síntese de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) ^5,6. A tolerância ao estresse ambiental é provavelmente facilitada pela EPS, e talvez pelo fisiolóadaptação tecnológico de bacilos indivíduo a microambientes heterogêneos dentro da complexa arquitetura de biofilmes ^7.

Em uma série de trabalhos recentes, estabeleceu que M. tuberculosis e Mycobacterium smegmatis têm uma forte propensão para crescer em organizados estruturas multicelulares, chamado biofilmes, que pode tolerar mais de 50 vezes as concentrações inibitórias mínimas das drogas anti-tuberculose isoniazida e rifampicina ^8-10. M. tuberculose, no entanto, intrigantemente requer condições específicas para formar biofilmes maduros, em proporção de 9:1 particular de headspace: meios bem como a troca limitada de ar com a atmosfera ^9. Requisitos de especializados condições ambientais poderia possivelmente ser ligada ao facto de que a M. tuberculosis é um patógeno humano obrigatório e, portanto, se adaptou aos ambientes de tecido. Nesta publicação, demonstrar os métodos para cultura de M. tuberculosebiofilme em uma garrafa e um formato de placa de 12 poços, que é conveniente para estudos bacteriológicos, bem como genéticos. Nós descrevemos o protocolo para uma estirpe atenuada de M. tuberculose, mc ^dois 7000, com supressão nos dois loci, panCD e RD1, que são críticas para crescimento in vivo do agente patogénico ^9. Esta variedade pode ser usado com segurança em uma contenção BSL-2 para a compreensão da biologia básica do patógeno tuberculose, evitando assim a exigência de uma instalação de BSL-3 caro. O método pode ser estendida, com modificação adequada em meios de comunicação, a crescer biofilme de outras espécies de micobactérias cultiváveis.

Em geral, um protocolo uniforme de biofilmes cultura de micobactérias vai ajudar os pesquisadores interessados ​​em estudar as características básicas resistentes de micobactérias. Além disso, um método claro e conciso do crescimento de biofilmes de micobactérias também irá ajudar o inv clínica e farmacêuticaestigators para testar a eficácia de um fármaco potencial.

Protocolo

1. Biofilmes de crescimento de M. tuberculose em uma garrafa de 250 ml com tampa de rosca

1. Preparação Media: Dissolver 0,5 g de KH ₂ PO _4, 0,5 g de _MgSO4, 4g de L-asparagina, 2g de ácido cítrico, 0,05 g de citrato de amónio férrico, 60mL de glicerol em 900ml de água. Ajustar o pH a 7,0 com NaOH. Autoclave, arrefecer e imediatamente antes de se iniciar a experiência, adicionar ZnSO estéril ₄ a uma concentração final de 0,1% w / v Desde mc ² 7000 é um auxotrofo pantotenato esta estirpe também requer ácido pantotênico em 10μg/mL de concentração final.

Discussão

A tuberculose (TB), causada pela infecção do Mycobacterium tuberculosis, continua a ser uma grande ameaça à saúde pública global. Quase um terço da população mundial é estimada para ser assintomática infectada pelo patógeno, cerca de 9 milhões de novos casos aparecem na clínica todos os anos com sintomas de tuberculose ativa e cerca de 1,7 milhões morrem da infecção a cada ano ^11. O enorme fardo da doença é essencialmente contribuído por falta de uma vacina e uma quimioterapia muito complicado, que e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora	VWR international	Modelo # 1923/25
Frasco de cultura de poliestireno	Fisher Scientific	03-374-300
Placa de cultura de tecidos com 12 poços	VWR international	62406-165
Tubos cónicos de 50 mL	VWR international	89039-660
Rocker	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
Refrigerador cromatográfico	VWR international	55702-520
Placa de Petri	VWR international	25384-342
KH2PO4 (monobásico)	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-asparagina	Sigma-Aldrich	A4284-100G
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich	C1857-100G
Citrato férrico de amónio	Sigma-Aldrich	F5879-100G
Glicerol	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
Ácido D-pantoténico	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Caldo Difco Middlebrook 7H9	BD Biosciences	271310
Enriquecimento Middlebrook OADC	BBL	212351
Tween-80	Fisher Scientific	T164-500
Frasco de armazenamento de 250 mL	Corning	430281
Placas de 12 poços	Falcon BD	353043
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Metanol	JT Baker	9070-05
Seringa de 10 mL	BD Biosciences	301604
Pontas de pipeta de 1-200μL	VWR international	89079-458
Parafilm M	VWR international	PM-996
Tubo cónico de centrífuga de 15 mL	Greiner Bio-One	188-285
Ágar Difco Mycobacteria 7H11	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4 (dibásico)	Sigma-Aldrich	S0876-500G