Artigo de método

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

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DOI:

10.3791/3860

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10 de março de 2012

 ,  ,  , 
1Faculty of Life Sciences, University of Manchester

Neste artigo

Resumo

Tentativas para expressam a fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR) em Saccharomyces cerevisiae Têm, até agora, produziu quantidades relativamente baixas de proteína. Este protocolo e os reagentes associados distribuídos através da Fundação de Fibrose Cística deve permitir a preparação de quantidades de miligramas desse "difícil" proteína de membrana eucariótica.

Resumo

A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR) é um canal de cloreto de que, quando mutado, pode dar origem a fibrose cística em humans.There é, portanto, um interesse considerável na presente proteína, mas os esforços para estudar a sua estrutura e actividade tem sido dificultada pela dificuldade de expressar e purificação de quantidades suficientes de proteína de 1-3. Tal como muitos 'difíceis' proteínas de membrana eucarióticas, a expressão num organismo de crescimento rápido é desejável, mas desafio, e na levedura S. cerevisiae, até agora baixas quantidades foram obtidos e rápida degradação da proteína recombinante foi observada 4-9. Proteínas envolvidas no processamento de CFTR recombinante em levedura foram descritos 6-9. Neste relatório nós descrevemos um método para a expressão de CFTR em levedura e sua purificação em quantidades significativas. O protocolo descreve como os problemas de proteólise anteriores podem ser ultrapassados ​​e os níveis de expressão de comoCFTR pode ser muito melhorada pela modificação das condições de crescimento de células e controlando as condições de indução, em particular o período de tempo antes de a colheita das células. Os reagants associados com este protocolo (CFTR murina expressando células de levedura ou plasmídeos de levedura) serão distribuídos através da Cystic Fibrosis Foundation EUA, que patrocinou a pesquisa. Um artigo descrevendo o projeto e síntese da CFTR construto utilizado neste relatório será publicado separadamente (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, inédito). Neste artigo, vamos explicar o nosso método de início com a transformação das células de levedura com a construção de CFTR - levedura contendo plasmídeo (Fig. 1). A construção tem uma sequência de proteína verde fluorescente (GFP) fundido com CFTR no seu terminal C e segue o sistema desenvolvido por Drew et al. (2008) 10. O GFP permite a expressão e purificação de CFTR a ser seguido de forma relativamente fácil. O protocolo JOVE visualizadosacabamentos ol após a preparação de microssomas a partir das células de levedura, embora incluem algumas sugestões para a purificação da proteína a partir dos microssomas. Os leitores pode desejar adicionar suas próprias modificações ao processo de purificação microssoma, dependente das experiências finais a serem realizadas com a proteína e do equipamento local disponível para eles. A levedura-expressa a proteína CFTR pode ser parcialmente purificada utilizando cromatografia de afinidade de iões metálicos, usando uma marca de purificação intrínseca poli-histidina. Cromatografia de exclusão de tamanho subsequente produz uma proteína que parece ser> 90% pura, conforme avaliado por SDS-PAGE e coloração com Coomassie do gel.

Protocolo

1. Preparação de Mídia e amortecedores

  1. YNB: Para um litro, suspender 6,9 g de base azotada de levedura sem aminoácidos e 0,77 g de mistura suplemento completo sem uracilo em 1 L de água. Autoclave. Armazenar a 4 ° C.
  2. YNBA: Para 400 ml, suspensão 2,76 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, 0,38 g mistura suplemento completo sem uracilo e ágar 8g bacteriológico em 350 ml de água. Autoclave. Misturar 8 g de glicose com 50 ml de água e aquecer suavemente até à dissolução. Esterilizar por meio de um filtro de 0,2 uM e adicionar à YNBA, enquanto que o agar é fundido. Armazene à temperatura ambiente.
  3. Médio glicose a 20%: Para 500 ml, misturar 100 g de glicose com 500 ml YNB e aquecer suavemente até à dissolução. Filtrar através de um filtro de 0,2 uM para uma garrafa de Duran estéril. Armazene à temperatura ambiente.
  4. Galactose médio de 20%: Para 2 litros, misture 400 g com galactose YNB 2l e aquecer lentamente até dissolver. Filtrar através de um filtro de 0,2 uM para uma garrafa de Duran estéril. Guarde-o em sala de temperamentotura.
  5. Protease ações inibidoras: CFTR é altamente suscetível à proteólise 4. Os autores encontraram os seguintes inibidores para ser eficaz em limitar a proteólise, embora os leitores podem querer adaptar esta lista para atender suas próprias necessidades. Armazenar em alíquotas de 100 ul a -20 ° C para reduzir os problemas de congelação-descongelação. Todos os inibidores da devem ser diluídas a partir das soluções-mãe para a concentração de trabalho como abaixo:
Inibidor Concentração estoque Preparação estoque Concentração de trabalho
AEBSF 200 mM Dissolver 48 mg em 1 ml de água destilada 0,2 mM
Benzamidina 300 mM Dissolver 36 mg em 1 ml de água destilada 0,3 mM
Quimostatina 4 mM Dissolve-se 2,5 mg em 1 ml de DM secoSO 4 mm
E 64- 7 mM Dissolver 2,5 mg em água destilada 1 ml 7 mM
Leupeptina 20 mM Dissolver 10 mg em 1 ml de água destilada 20 uM
Pepstatina A 15 mM Dissolve-se 10 mg em 1 ml de DMSO seco 15 uM
PMSF 1 M Dissolve-se 174mg em 1 ml de DMSO seco 1 mM
  1. DTT (1 M): Dissolver 154 mg de ditiotreitol em água destilada 1 ml. Armazenar a -20 ° C. Use por diluição 1:1000 em tampões indicados.
  2. EDTA (0,5 M): mistura de 29,22 g de ácido etilenodiaminotetracético com 100 ml de água. Adicionar gota a gota NaOH 10 N até todo o EDTA tem dissolvido e que o pH atinja 8. Perfaz-se a 200 ml com água e passar através de um filtro de 0,2 um para um frasco estéril Duran. Armazene à temperatura ambiente.
  3. CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M de sorbitol, EDTA 1 mM): Dissolver 18,17 g de Tris-base em 350 ml de água e ajustar o pH a 7,4 por adição de HCl. Adicionar 51,35 g de sorbitol e fazer o volume até 500 ml com água. Autoclave. Adicionar 1 ml de solução stock de EDTA e armazenar a 4 ° C.
  4. CFTR tampão (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v de glicerol): Dissolver 6,06 g de Tris-base em 500 ml de água. Ajustar o pH a 8 com HCl, adicionar 100 ml de glicerol e perfazer a 1 L com água. Autoclave e armazenar a 4 ° C.
  5. 2x corante de carga: 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), glicerol 5%, EDTA 5 mM (pH 8,0), 0,02% de azul de bromofenol, SDS 4%, 0,05 M DTT. Faça alíquota de 10 ml, e armazenar a -20 ° C.

2. Os transformantes de triagem

Este protocolo assume que o gene de fusão CFTR-GFP-8His foi inserido a jusante de um plasmídeo de levedura a um promotor GAL1 galactose (Fig.1) e que o plasmídeo foi transformado em células FGY217, uma deleção PEP4 mutante de S. cerevisiae 10 . As células podem ser cultivadas em placas de YNBA e armazenada durante várias semanas a 4 ° C. Para armazenamento a longo prazo, as unidades de glicerol deve ser feita, e armazenadas a -80 ° C. Métodos para a clonagem e transformação são descritos em detalhe por Drew et al. (2008) 10.

  1. Escolha 5-10 bem separados colónias de uma placa de transformação. Transfira cada colónia para um separada 50 ml estéril tubo Falcon contendo 9 ml YNB e 1 ml de meio de glicose a 20%. Para esta etapa, é importante ter uma concentração final de glicose a 2% (w / v) na cultura para manter o crescimento celular. Crescer durante a noite durante 16 horas a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação.
  2. As existências de glicerol para cada uma das colónias filtrados. Adicionar assepticamente 0,8 ml das culturas durante a noite para 0,2 ml de glicerol estéril em rotulados parafuso-top frascos, brevemente vórtice e armazenar a -80 ° C.
  3. Diluir as culturas restantes durante a noite para um volume final de 50 ml em YNB, incluindo 250 uL de meio de glicose a 20%.Para esta etapa, é importante para diluir a concentração de glucose a cerca de 0,1% (w / w) na cultura porque glucose elevada pode reprimir o promotor GAL1 10. Crescer culturas em rotulada 250 ml de Erlenmeyer confundido frascos para um OD 600 de 0,7-0,8 a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação.
  4. Induzir as culturas por adição de 5 ml médio galactose a 20% em cada balão e crescer em durante 16 horas.
  5. Confirmar a expressão de CFTR usando microscopia de fluorescência. Tome 100 ul de cultura e adicionar 100 uL de glicerol para limitar a mobilidade de células em solução. Analisar as células de uma RT Visão Delta microscópio restauração (ou semelhante), usando um laser azul sob um filtro FITC (comprimento de onda de excitação de 490 nm e comprimento de onda de emissão de 528-538 nm). Expressão positiva da proteína de fusão CFTR-GFP deve ser visível como um anel de fluorescência na membrana plasmática das células de levedura. Células de levedura não transformadas pode ser utilizado como um controlo.
  6. Transferir oculturas em tubos Falcon de 50ml. Colher as células por centrifugação a 3500 xg, 4 ° C durante 10 minutos numa centrífuga de bancada. Enquanto a centrífuga está em execução, preparar tubos de microcentrífuga 2 ml com tampa de rosca contendo aproximadamente 500 ul contas ácido-lavadas de vidro e colocar no gelo. Descartar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 500-800 CRB gelada ul com inibidores da protease. Transferir as suspensões para os tubos de microcentrífuga contendo as pérolas e manter em gelo.
  7. Lisar as células por vigorosamente agitação / vortex cada tubo de microcentrífuga durante 10 períodos de 30 segundos, repousando sobre gelo entre períodos. Um beadbeater pode ser empregue como uma alternativa, por exemplo, uma mini-BioSpec beadbeater operado durante 3 min.
  8. Colocar os tubos em um de microcentrífuga de bancada e centrifugar a 3500 xg, 4 ° C durante 5 minutos. Transfira os sobrenadantes contendo a população de membrana em bruto para limpar tubos de microcentrífuga e colocar em gelo. Adicionar 500 ul fresco gelo co-ld CRB com inibidores de protease a cada tubo e repetir o processo para acumular as membranas.
  9. Recolher as membranas em bruto por fiação à velocidade máxima, 4 ° C numa microcentrífuga de bancada durante 2 horas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em cada 50 uL de tampão CFTR gelada.
  10. Em tubos de microcentrífuga limpas, misturar 15 ul de cada suspensão com 15 corante carga ul 2x por pipetagem cima e para baixo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Não ferver as amostras, como isso fará com que as proteínas da membrana CFTR e outro para formar agregados insolúveis SDS-e também desnaturar a marca GFP.
  11. Carregar as amostras, juntamente com padrões proteicos PageRuler Além disso prestained (Fermentas) para um 4-20% de Tris / glicina em gel com gradiente (NuSep) e executar a 150 V durante 40 minutos ou até que a frente de corante-se na parte inferior do gel.
  12. Identificar os mais elevados por células que expressam em gel de fluorescência. Coloque em um sistema de imagens de fluorescência, como um scanner Typhoon. Digitalizar o u gelcantar o laser azul em um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 526 nm. A fusão CFTR-GFP deve ser visível a cerca de 220 kDa. Haverá também uma banda fraca fluorescente visível a cerca de 70 kDa que é provavelmente uma levedura intrínseca FAD contendo proteína de membrana (tal como succinato desidrogenase subunidade A) 11,12.
  13. Corar o gel com Coomassie, destain e digitalizar o gel para comparação com a verificação de fluorescência usando um pacote de software conveniente imagem de visualização. O gel corado com Coomassie permite uma avaliação relativa dos níveis de CFTR-GFP de expressão em diferentes linhas clonais após normalização para a quantidade de proteína total foram carregados em cada faixa do gel.
  14. Streak a linha celular mais alta expressão de seu estoque de glicerol (2,2) em um YNBA fresco placa e incubar a 30 ° C durante 2-3 dias. Esta placa pode então ser armazenado por até 2 semanas a 4 ° C.

3. Em larga escala Cult Fermenterure

  1. Preparar pré-culturas para o fermentador. Raspe uma área de 2 1cm de células do YNBA placa (2,13), utilizando uma agulha esterilizada e adicionar a 45 ml YNB e 5 ml de meio de glicose a 20%, de tal modo que o OD 600 é de aproximadamente 0,1. Crescer em balões de 250 ml de Erlenmeyer confundiu a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação até a DO 600 atinge 1.
  2. Dividir a cultura entre dois 2 l Erlenmeyer confundido balões contendo cada uma 450 ml YNB e 25 ml de meio de glicose a 20%. Crescer estas sobre a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação até a DO 600 atinge 1,2.
  3. Embora estas culturas pré-estão crescendo, configurar o fermentador. Fazer 11.2l de YNB como descrito em 1.1, mas dissolver um adicional 8,28 g YNB e 0,95 g gota fora suplemento para compensar a adição de glicerol na indução. Assepticamente adicionar a 11,2 l YNB e 75 ml de meio de glucose de 20% a um vaso fermentador estéril 20L e ajustar a temperatura de funcionamento para30 ° C.
  4. Assepticamente adicionar os precultura para o fermentador e definir a velocidade de agitação a cerca de 800 rpm e manter a temperatura a 30 ° C. O ar comprimido deve fluir em aproximadamente 15 dm 3 min -1. Uma vez que a cultura atinge um fermentador de OD 600 de 1,2, induzir, assepticamente, a adição de 1,5 l YNB solução de galactose a 20% e 1,2 glicerol l. Reduzir a temperatura a 25 ° C e crescer a cultura durante 16 horas.
  5. Transferir o conteúdo do fermentador em potes de centrífuga refrigerada 1l sobre gelo utilizando uma bomba peristáltica. Colher as células por centrifugação a 3.500 xg, 4 ° C durante 30 minutos num rotor de grande capacidade (por exemplo, 6 litros). Ressuspender as células em 150 ml de gelo CRB frio com inibidores de protease. Daqui em diante, todo o trabalho deve ser realizado a 4 ° C.
  6. Lisar as células por passagem através de um disruptor Constante sistemas de células em 4 passagens em 25, 30, 32 e 35 kPa, recolhendo o lisado em gelo, em cada caso. Em alternativa, usar um talão beater (Biospec) com um volume igual de ácido-esferas de vidro lavadas 0,5 mm e agitar durante 3 minutos na potência máxima. Transferir o lisado de 50ml Falcon tubos e pellet os restos celulares por centrifugação a 3.500 xg, 4 ° C durante 15 minutos numa centrífuga de bancada.
  7. Transferir o sobrenadante para tubos de centrífuga refrigerada. Centrifugar a 14.000 xg, 4 ° C durante 30 minutos numa centrífuga para remover mitocôndrias.
  8. Transferir o sobrenadante para tubos de ultracentrifugação refrigerados. Centrifugar a 200.000 xg, 4 ° C durante 90 minutos em uma ultracentrífuga para recolher microssomas.
  9. Decantar cuidadosamente e descartar o sobrenadante e adicionar 2 ml de tampão de gelo CFTR frio com inibidores da protease e DTT 1 mM a cada tubo. Volte a suspender suavemente as bolinhas usando um pincel, topo-se cada tubo com tampão CFTR e misture usando um misturador de vórtice.
  10. Centrifugar a suspensão a 200.000 xg, 4 ° C durante 60 minutos em uma ultracentrífuga, descartar os peletes sobrenadante e ressuspender em 2 ml de tampão arrefecido em gelo CFTR with inibidores de protease (Sem DTT), utilizando um pincel.
  11. Reúnem-se os microsomas ressuspensão, ajustar o volume final para 50 ml com tampão de CFTR e misturar bem. Reserva uma alíquota de 1 ml para análise SDS-PAGE em gel, como descrito no 2,9-2,11. Os microssomas pode agora ser flash congelados em azoto líquido e, em seguida, armazenada a -80 ° C até serem necessários.
  12. CFTR pode ser extraído a partir de microssomas usando um dos seguintes: detergentes lítio perfluorooctonoate ácido (LiPFO), tetradecanoly-liso fosfatidilglicerol-(LPG14), n-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM). Misturar os microssomas com tampão CFTR, os inibidores da protease e 5% de detergente (w / w). Se DDM é usado, também adicionar NaCl 300 mM para o buffer. Agitar a 4 ° C durante 15 minutos num rotor tubo.
  13. Centrifugar as amostras a 100.000 xg, 4 ° C durante 1 hora em uma ultracentrífuga. Reter o sobrenadante e tomar uma pequena alíquota para SDS-PAGE análise em gel. CFTR pode agora ser purificado a partir do material solublised por metal imobilizadocromatografia de afinidade, seguido por cromatografia de exclusão de tamanho.

4. Os resultados representativos

Transformação de levedura com o plasmídeo contendo CFTR não é 100% eficiente. Uma tela de pequena escala representativa de expressão de CFTR em colónias seleccionadas a partir de uma experiência de transformação irá produzir cerca de 1 em 4 colónias que expressam a proteína. Um resultado típico de uma tela de 5 colónias separado a partir de uma placa é mostrado no painel A da fig. 3. Uma das colónias mostra uma forte nível de expressão da proteína de fusão CFTR-GFP que funciona tipicamente entre os 250 kDa e 130 kDa marcadores, como mostrado. Os níveis de CFTR-GFP fluorescência irá variar consideravelmente entre experiências, com colónia na Fig. 4. 3 mostrando pelo menos fluorescência 10x maior do que a banda intrínseca de fluorescência a cerca de 70kDa. Se os níveis de expressão de CFTR-GFP parecem dar menos de fluorescência do que a banda de 70 kDa, então é provavelmente valor re-transformando e escolhendo uma colóniacom níveis mais elevados de CFTR-GFP expressão. Como mostrado na fig. 3A, é improvável, mesmo com um nível de expressão elevado de CFTR-GFP, que a banda CFTR-GFP será visível no extracto celular por coloração com Coomassie.

Uma vez que as colónias seleccionadas foram cultivadas em experiências de maior escala, e microssomal isolado, a presença de CFTR-GFP dentro dos microssomas terá de ser avaliada, como mostrado na fig. 3B. Os resultados desta experiência são importantes, não só para avaliar a eficiência da indução da expressão, mas também para verificar que os microssomas foram preparados cuidadosamente e que a proteólise foi minimizada. Os resultados mostrados na Fig. 3B implica que nesta experiência a expressão de CFTR GFP-é um pouco menor (como julgado em relação à banda intrínseca 70kDa) do que na experiência em pequena escala mostrada no painel A. No entanto esta impressão é influenciado pela exposição excessiva do detector de fluorescência na presente medição. Isto porque o experimentador era Checking para a presença de fragmentos proteolíticos do CFTR construir. Existe alguma evidência nesta experiência para alguns fragmentos proteolíticos fluorescentes entre os 130 kDa e 100 kDa marcadores, mas estes são muito fraca em comparação com a banda de comprimento completo CFTR GFP. Com os inibidores da protease aqui descrito, encontramos pouca evidência para a degradação proteolítica da CFTR após ruptura das células. Se proteólise significativa é observada, recomendamos fazer novas soluções de protease inibidores. Descobrimos também que comerciais de protease comprimidos de cocktail de inibidores não são tão eficazes para este sistema. Crescimento de células para além de 16 horas (pós-indução) irá dar origem a expressão de CFTR diminuiu como mostrado na Figura 4. Isto é provavelmente devido ao volume de negócios da proteína, talvez devido à regulação positiva da levedura mecanismos de controlo da qualidade protéica 6-9,13. Por isso, é aconselhável monitorizar os níveis de expressão do gene CFTR após a indução com galactose, se possível, como o tempo ideal para a colheita das células may variam de um laboratório para outro.

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Figura 1. O construto CFTR levedura contendo o plasmídeo. A fusão CFTR-GFP-8His é inserido no vector de expressão 2μ p424GAL1, sob o controlo de um promotor de galactose (GAL1). O vector também contém um marcador de selecção de uracilo (URA) e um gene de resistência à ampicilina (Amp).

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Figura 2. Um fluxograma que resume o protocolo visualizadas.

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Figura 3. Representativos géis de SDS-PAGE de expressão de CFTR e purificação. O painel A mostra cinco colónias transformantes escolhido aleatoriamente (pistas 1-5), que foram rastreadas para a expressão de CFTR. O painel B mostra microssomas que foram isoladas a partir de um FERM 15Lentrar cultura. O painel C mostra purificado CFTR murino obtido após duas fases de purificação utilizando cromatografia de afinidade, seguido por cromatografia de exclusão de tamanho. Todos os géis são mostradas sob condições de iluminação fluorescente emocionante a partir do domínio GFP (esquerda) e depois Coomassie manchar (direita). As posições relativas dos padrões de peso molecular estão listados no lado esquerdo (kDa).

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Figura 4. Os dados representativos para a expressão de CFTR em levedura. O painel A mostra um tempo-curso de expressão de CFTR após indução com galactose. Os extractos celulares foram analisados ​​por SDS-PAGE, ea fluorescência da GFP para a banda de proteína CFTR-GFP foi integrado. B Painel mostra os resultados típicos para microscopia de fluorescência de GFP células que expressam 16 após a indução hr. Tipicamente, apenas uma fracção das células expressar CFTR em níveis elevados.

Discussão

Este documento apresenta um método para a expressão da proteína CFTR murino em células de levedura, que deve facilitar a pesquisa sobre a fibrose cística. O objetivo é vincular esse papel com o lançamento do murino CFTR DNA construção, que estará disponível através da Cystic Fibrosis Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Ortólogos outro deve ficar disponível mais tarde. Transformação das células de levedura com o vector contendo CFTR é simples, mas é importante para o rastreio de colónias que expressam níveis elevados de CFTR. Os níveis de expressão variável pode surgir a partir de vários factores, mas o número de cópias do plasmídeo por célula provavelmente representa um grau significativo de variação. As etapas críticas descritas aqui devem permitir a produção de CFTR expressam células de levedura e CFTR contendo membranas microssomais. Uma vez que a transformação, o crescimento da colheita, e lise de células de levedura foram dominados, Purificação da proteína deve ser possível, e na Figura 3, deram um exemplo da pureza que deve ser exequível, neste caso, como valor de referência útil. Não é nossa intenção neste manuscrito para fornecer metodologia detalhada para a purificação da proteína. No entanto, há algumas críticas passos de purificação a jusante que são específicos para o sistema de expressão S.cerevisae, tais como a lise das células e purificação microssoma, e estes foram incluídos em detalhe neste manuscrito. Deve ser mencionado, contudo, que para além dos dois métodos já foram utilizados, alternativas de levedura métodos rompimento celular podem ser empregues, tais como a utilização de uma célula de pressão francesa. A proteína recombinante tem um TEV-clivável domínio GFP C-terminal que permite que a proteína a ser rastreado após a indução (Fig. 4). A levedura tem uma proteína intrínseca 70kDa (provavelmente succinato desidrogenase 12), que fluoresce sob as mesmas condições de 11, e este pode proporcionar um entre útilpadrão de calibração nal para os níveis de expressão relativa da CFTR em extractos de células inteiras ou microssomas (Fig. 3). É evidente a partir dos dados mostrados na Figura 4 que o momento da colheita de células após a indução com galactose é crucial. As produções de gota CFTR precipitadamente após cerca de 16 h de indução, de modo que não há quase qualquer CFTR detectável em células de levedura após 24 h de indução.

O rendimento de proteína purificada é de cerca de 1-2mg proteína CFTR por 15 cultura fermentador litro. A recuperação pode ser estimada como cerca de 70% da proteína CFTR GFP-total até ao estádio de microssoma, e recuperação de cerca de 25% da proteína purificada. Caracterização da S. cerevisiae, expressa CFTR está em curso. Como visto na fig. 4, a localização da proteína na célula pode ser monitorizada por microscopia de fluorescência. Embora muito da fluorescência é encontrada ao redor da periferia da célula como 10 esperado, alguma da proteína exibe uma localização ponteada, quer em, ouapenas no interior da membrana plasmática, que pode ser devido a CFTR reciclagem através de uma via de Golgi / endossomal tardia 14 ou talvez a jusante compartimento da floração de vesículas de transporte do ER 4. O tratamento com PNGaseF, uma enzima que deglycosylates proteínas, mostraram alteração mínima da migração da banda de proteína CFTR em SDS-PAGE, o que implica que é não glicosilada, ou tem de glicosilação mínimo 15. Experiências sobre o estado de fosforilação da proteína estão em curso. Em alguns dos detergentes testados até à data, a proteína purificada exibe actividade ATPase (que é inibida por um inibidor específico CFTR 16) a taxas que são semelhantes aos anteriormente publicado 2,15. Medição da actividade do canal CFTR exigirá a reconstituição da proteína purificada, o que implicaria um passo de purificação final em um detergente que tem uma relativamente elevada concentração micelar crítica (CMC) 17. Levedura microssomas containing CFTR pode ser solublised com vários detergentes vulgarmente utilizados 18, incluindo detergentes tais como dodecil maltosídeo 2, os quais são geralmente considerados 'suave'. No entanto mais elevados detergentes cmc provaram ser ineficientes para solubilsation, até agora, o que sugere que em troca estes detergentes devem ser considerados numa fase tardia em qualquer esquema de purificação.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Agradecemos a Cystic Fibrosis Foundation (CFF) para o financiamento deste trabalho através da sua Consórcio Estrutura CFTR 3D (subvenção número FORD08XX0). Reconhecemos a enorme contribuição de todos os nossos colegas dentro do Consórcio para este trabalho, em particular na concepção dos genes CFTR. Agradecemos também as valiosas contribuições dos drs. James Birtley (NCSR Demokritos, Grécia), Mark Young (Universidade de Cardiff, Reino Unido) e David Drew (Imperial College, Londres, Reino Unido) nos estágios iniciais do trabalho. Agradecemos especialmente a Dra. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) para a leitura crítica do manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome de reagente / equipamentos Companhia No Catálogo
FGY217 estirpe S. cerevisiae, com supressão pep4 10
Base de levedura de nitrogênio sem aminoácidos Formedium CYN0410
Conclua mistura suplemento sem uracil Formedium DCS0169
Ágar bacteriológico Sigma-Aldrich A5306
D-galactose Pescador BP656-500
D-glucose Pescador D16-500
Pepstatina A Sigma-Aldrich P4265
Leupeptina Merck 108975
Quimostatina Sigma-Aldrich C7268
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Epoxysuccinyl leucylamido-butano-(E-64) Sigma-Aldrich E3132
Fluoreto Aminoethylbenzenesulfonyl (AEBSF) Sigma-Aldrich A8456
Cloridrato de benzamidina Sigma-Aldrich 434760
Dimetilsulfóxido (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
ditiotreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) Pescador BP120500
Tris-base Formedium TRIS01
Tris-HCl Pescador P631
D-sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Glicerina Pescador 065017
NaCl Sigma-Aldrich S6191
N-dodecil-β-D-maltopyranoside Affymetrix D310S
Azul de bromofenol Sigma-Aldrich 114391
Além disso PageRuler padrões proteicos prestained Fermentas SM1811
NuSep tris-Gly 4-20% géis de gradiente NuSep NB10-420
Instantânea azul Coomassie Mancha Novexin ISB1L
Contas de vidro, lavado com ácido Sigma G8772
50ml estéreis Tubos Falcon Sarstedt 62.547.254
2mlEstéreis tampa de rosca frascos Sarstedt 72.694.005
250ml Erlenmeyer estéril perplexos BD Biosciences 355119
Erlenmeyer estéril 2l perplexo frascos BD Biosciences 355131
2ml tubos de microcentrífuga Sarstedt 72,695
0.2μM filtro de seringa Músculo da coxa FC121
tubos de ultracentrífuga Beckman Coulter 355618
tubos de centrífuga Beckman Coulter 357000
1l potes de centrífuga Beckman Coulter 969329
Orbital agitação incubadora com controlo de temperatura New Brunswick Scientific
Deltavision RT microscópio restauração Aplicada Visão
Centrífuga de bancada Hermle Z300
Microcentrífuga de bancada Pescador 13-100-511
Vortex Estrela Labs
Typhoon Scanner Trio GE Healthcare 63-0055-87
LAS3000 sistema de imagem Fuji
Navio fermentador 20l e unidade de controle Applikon
Desregulador constante de célula sistemas Sistemas constantes
Beadbeater disruptor celular BioSpec 1107900
Mini-beadbeater-16 BioSpec 607
JA-17 rotor Beckman Coulter 369691
Optima L-100 ultracentrífuga Beckman Coulter 392050
Rotor 50.2Ti Beckman Coulter 337901

Referências

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