Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais Formadoras de Colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano

Resumo

Células endoteliais que formam colônias (ECFCs) estão circulando células endoteliais com potencial clonal proliferativa robusto que exibe intrínseco In vivo capacidade de formação. Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais excrescência derivados de CB são importantes para identificar e isolar Bona fide ECFCs potencial para aplicação clínica na reparação de tecidos danificados.

Resumo

Vistas de longa data de formação de novos vasos sanguíneos através de angiogênese, vasculogênese e arteriogênese foram avaliados recentemente ^1. A presença de circulação de células progenitoras endoteliais (EPCs) foram primeiramente identificadas no sangue periférico humano adulto por Asahara et al. Em 1997 ² trazendo uma infusão de novas hipóteses e estratégias para a regeneração e reparação vascular. EPCs são raras, mas os componentes normais do sangue circulante de que o lar de locais de formação dos vasos sanguíneos ou remodelação vascular, e facilitar quer vasculogênese pós-natal, a angiogênese, ou arteriogênese em grande parte através da estimulação parácrina de parede do vaso existente derivadas de células ^3. Nenhum marcador específico para identificar um EPC foi identificado, e no presente estado do campo é entender que tipos de células-tronco hematopoiéticas, incluindo numerosos proangiogenic e células progenitoras, células circulantes angiogênicas, TIE2 ^{+ de} monócitos, cel progenitor mielóidels, tumorais macrófagos associados, e M2 macrófagos activados participar em estimular o processo angiogénico em uma variedade de sistemas de modelos animais e pré-clínicos em seres humanos em numerosos estados de doença ^{4, 5.} Células endoteliais que formam colônias (ECFCs) são raras circulantes células endoteliais viáveis ​​caracterizadas por potencial robusto clonal proliferativa, colônia secundária e terciária capacidade de formação sobre repique, e capacidade de formar intrínseca em vasos in vivo sobre o transplante em ratos imunodeficientes ^6-8. Enquanto ECFCs foram isoladas com sucesso a partir do sangue periférico de indivíduos adultos saudáveis, o sangue do cordão umbilical (CB) de recém-nascidos saudáveis ​​e parede do reservatório de numerosos humanos vasos arteriais e venosos ^6-9, CB possui a maior freqüência de ECFCs ⁷ que exibição o mais robusto potencial clonal proliferativa e forma os vasos sanguíneos duráveis ​​e funcionais in vivo ^{8, 10-13.} Enquanto a derivação deECFC a partir de sangue periférico adulto tem sido apresentada ^{14, 15,} aqui descrever as metodologias para a derivação, a clonagem, a expansão, e in vitro em bem como em caracterização in vivo das ECFCs do umbilical humano CB.

Protocolo

Reagentes e Soluções

EMG-2 de mídia (Lonza, Cat. No. cc-3162-2 contendo EBM meio basal e EGM-2 Suplementos kit SingleQuot, e fatores de crescimento)

EBM-2 (Lonza, Cat. No. cc-3156) suplementado com os suplementos SingleQuot inteiras kit e factores de crescimento (Lonza, Cat. No. cc-4176), 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina (10.000 U / ml) / estreptomicina (10.000 ug / ml) / anfotericina (25 ug / ml). Armazene até 1 mês a 4 ° C. Recomendadas EGM-2 volumes a serem usados ​​para a cultura ECFC são 500 uL / poço de placas de 24 poços, 2 ml / poço de placas de 6 poços, ² 5ml/25-....

Discussão

Caracterização fenotípica e funcional dos putativos células progenitoras endoteliais é importante para identificar os ECFCs autênticas que são capazes de clonalmente e serialmente re-plaqueamento em cultura e dar origem a duráveis ​​e funcional vasos sanguíneos implantáveis ​​in vivo. O sangue do cordão umbilical humano é enriquecido com ECFCs ea concentração desses declínios células circulantes com o envelhecimento ou a doença de ^10. Estudos recentes sugerem que ECFC podem desempenhar papéi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Injeção de heparina sódica, USP	APP Pharmaceuticals	504031
Ficoll-Pague	Amersham Biosciences	17-1440-03
Cânula de mistura	Maersk Medical	500.11.012
EGM-2	Lonza	CC-3162
FBS definido	Hyclone	SH30070.03
TrypLE expressa	Gibco	12605
Tipo Rat colágeno I	BD Biosciences	354236
Matrigel	BD Biosciences	356234
FcR Bloco	Miltenyi Biotech	130-059-901
hCD31, FITC Conjugated	BD Pharmingen	555445
hCD45, conjugado com FITC	BD Pharmingen	555482
hCD14, conjugado com FITC	BD Pharmingen	555397
hCD144, PE conjugado	eBioscience	12-1449-80
hCD146, PE conjugado	BD Pharmingen	550315
hCD105, PE conjugado	Invitrogen	MHCD10504
Ms IgG 1, o anticorpo k, conjugado com FITC	BD Pharmingen	555748
Ms IgG 1, o anticorpo k, PE conjugado	BD Pharmingen	559320
Ms IgG 2a, o anticorpo k, conjugado com FITC	BD Pharmingen	555573
Anti-CD31 humano	Dako	clone JC70 / A
Anti-mouse CD31	BD Pharmingen	553370
0,22 mícrons sistema de filtração de vácuo	Millipore	SCGPU05RE
Ácido acético glacial, 17.4N	Pescador	A38-500
Antibiótico-antimicótica	Invitrogen	15240-062
Soro fetal de bovino (FBS)	Hyclone	SH30070.03
IHC zinco Fixação	BD Biosciences	550523
Sytox reagente verde	Invitrogen	S33025
Cilindros de clonagem, estéreis	Fisher Scientific	07-907-10