Research Article
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Cruzamentos sexuais e isolamento da progênie recombinante são importantes ferramentas de pesquisa para o fungo filamentoso,
Fusarium graminearum tornou-se um sistema modelo para estudos em desenvolvimento e patogenicidade de fungos filamentosos. F. graminearum mais facilmente produz corpos de frutificação, chamados peritécios, em ágar cenoura. Peritécios conter inúmeros tipos de tecidos, produzidas em fases específicas do desenvolvimento peritécio. Estes incluem (por ordem de aparecimento) a formação de as iniciais peritécio (que dão origem às hifas ascogenous), a parede exterior, paráfise (micélios estéril que ocupam o centro do peritécio até que o ascos desenvolver), o ascos, e os ascósporos dentro do ascos 14. O desenvolvimento de cada um destes tecidos é separado por aproximadamente 24 horas e tem sido a base em estudos transcriptomic durante o desenvolvimento sexual 12,8. Consulte Hallen et al. (2007) para uma descrição mais completa do desenvolvimento, incluindo fotografias de cada etapa. Aqui, apresentamos os métodos para gerar e colher síncronaly desenvolvimento de gramados de peritécios para estudos temporais de regulação gênica, desenvolvimento e processos fisiológicos. Embora estes métodos são escritos especificamente para ser utilizado com F. graminearum, as técnicas podem ser utilizadas para uma variedade de outros fungos, desde que a frutificação pode ser induzida em cultura e há algum sincronia com o desenvolvimento. Recentemente adaptado este protocolo para estudar o desenvolvimento sexual de F. verticillioides. Embora peritécios indivíduo deve ser colhido manualmente nesta espécie, porque um gramado de desenvolver peritécios não poderia ser induzido, o processo funcionou bem para estudar o desenvolvimento (Sikhakolli e Trail, inédito).
A função mais importante de corpos de frutificação de fungos é a dispersão de esporos. Em muitas das espécies de Ascomycota (ascus produzindo fungos), os esporos são disparadas a partir do ascus, devido à geração de pressão de turgescência dentro do ascus, dirigindo ejecção de esporos (e fluido epiplasmic) através doporo na ponta ascus 2,7. Nossos estudos de descarga de ascósporos forçada resultaram no desenvolvimento de um "ensaio de descarga de esporos", que usamos para triagem de mutações no processo. Apresentamos aqui os detalhes deste ensaio.
F. graminearum é homothallic e, portanto, pode formar corpos de frutificação, na ausência de um parceiro compatível. A vantagem de homothallism é que atravessamento não é necessária para gerar descendência homozigótica para um traço particular, uma faceta que facilitou o estudo do desenvolvimento sexual nesta espécie 14,7. No entanto, as estirpes heterotálico ter sido gerados que podem ser utilizados para a passagem 5,9. É também possível para atravessar as estirpes homothallic para se obter mutantes para vários genes na estirpe um 1. Isso é feito por coinoculating uma placa de Petri com 2 estirpes. Ao longo do ponto de encontro, a maioria dos peritécios será recombinante (fornecida uma mutação em uma das estirpes-mãe não inibede cruzamento). Com a idade peritécios, eles exalam ascósporos em massa ao invés de descarregá-los à força. O exsudado de esporos resultante (chamado um cirrhus) senta-se a ponta do peritécio e pode ser facilmente removido para a recuperação de esporos individuais. Aqui nós apresentamos um protocolo para facilitar a identificação de recombinante peritécios ea recuperação da progênie recombinante.
1. Produzindo peritécios
2. Ensaio de descarga de ascósporos
3. Geração de progênie recombinante
4. Os resultados representativos
Produzindo peritécios
O objectivo é ter um relvado deperitécios sem qualquer micélios ou esporos aparentes. A superfície da cultura aparecerá semelhante a veludo preto (Figura 1). Aos 24 hr após a aplicação de Tween a superfície do ágar deve ter um ligeiro brilho. Se micélios reaparecer, então a placa não pode ter sido raspada suficiente para induzir o desenvolvimento peritécio.
Ascósporos de descarga
Sempre fornecer na sua ensaio vários blocos de agar a partir da estirpe de tipo selvagem. Se aqueles que não fazer fogo, em seguida, os peritécios são demasiado jovem ou demasiado velho. Se eles são muito antiga, em seguida hifas numerosos irá aparecer sobre a superfície da cultura dando-lhe uma tonalidade esbranquiçada. Se este não for o caso, eles podem ser muito jovens, e no ensaio deve ser tentada de novo em 24 hr. Ocasionalmente, as culturas não cumprir bem, eo experimento terá que ser repetido. Certifique-se de realizar o ensaio nas condições de luz adequadas.
Progênie recombinante
Figura 1. Estágios de desenvolvimento peritécio em agar de cenoura. H, para a esquerda 72 após a aplicação de Tween. Observação pigmento vermelho e peritécios muito jovem visível como uma grãos negros na superfície. Direito de, a 144 h, peritécios maduros ter se formado. Nota quase completa ausência de micélio superficial em ambas as culturas.
Figura ensaio de descarga 2.. A ficha de agar de laranja cenoura é orientada de modo thaesporos t forçosamente descarregadas a partir do peritécios maduro na sua superfície podem acumular-se sobre a superfície da lâmina de vidro. 15 hr tempo de acumulação.
Figura 3. Diferenças de crescimento entre Nit + e-NIT colônias em meio MMTS seletivo. As colónias nit-(pontas de seta) são menores. A NIT + de colônias (setas) mostram um crescimento robusto. Fotografia tirada depois de 7 dias.
Não temos nada a divulgar.
Cruzamentos sexuais e isolamento da progênie recombinante são importantes ferramentas de pesquisa para o fungo filamentoso,
Este trabalho foi suportado por uma concessão do National Science Foundation (MCB-0923794 para FT).
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo |
| Fusarium graminearum estirpe PH-1 | Fungal Genetics estoque Center, Kansas | FGSC 9075 |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 |
| Agar Czapek Dox do | Difco, Becton Dickinson | 233810 |
| Cloreto de Potássio | Sigma-Aldrich | 255572 |
