Name: Desenvolvimento Sexual e descarga de ascósporos em Fusarium graminearum /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprenda a induzir desenvolvimento sexual e descarga de ascósporos em Fusarium graminearum usando ágar de cenoura. Este método permite avaliar progênies recombinantes e rastrear mutantes em reprodução fúngica.

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Este trabalho foi suportado por uma concessão do National Science Foundation (MCB-0923794 para FT).

1. Produzindo peritécios <ol><li> Centro de ágar cenoura inocular 10 em um centímetro de diâmetro 6,0 prato de Petri com uma cepa fértil de F. graminearum (Recomenda PH-1). </li><li> O local de inoculação de pratos sob brilhantes luzes fluorescentes à temperatura ambiente (18-24 ° C) e deixa-se crescer até micélio tenha atingido o bordo exterior da placa de Petri (3-5 dias). Luzes fluorescentes domésticas comerciais funcionam bem para estimular a formação de frutificação corpo e descarga. </li><li> Remova cuidadosamente o micélio aéreo com um palito estéril. </li><li> Distribuir 1,0 ml 2,5% de Tween 60 aq à superfície com uma hockeystick vidro estéril ou extremidade arredondada de uma vareta de vidro estéril. </li><li> Retornar placas à luz. Não adicione Parafilm para placas. </li><li> Após 24 h, a superfície das placas devem ter uma aparência brilhante. Se micélios reaparece, raspagem de superfície e reaplicar Tween-60 solução. </li><li> Observe o desenvolvimento de peritécios na próxima semana. Os estágios intermediários dedesenvolvimento peritécio pode ser colhido por suavemente raspagem da superfície do agar e flash congelado para RNA de extracção (Figura 1). </li><li> Esporos maduros irá acumular-se na tampa do prato por dia 7. Inicialmente, estes só será visível sob um microscópio de dissecação, mas por dia 9, eles irão ter acumulado à densidade suficiente de modo a ser visível a olho nu. </li></ol> 2. Ensaio de descarga de ascósporos <ol><li> No dia 6 após a aplicação da solução de Tween, cortar um círculo 1 cm de diâmetro para fora do ágar com uma broca de madeira. Alternativamente, um bisturi pode ser usado para remover um segmento de dimensões semelhantes. O círculo pode ser cortado ao meio e cada metade colocada numa lâmina de microscópio de vidro. </li><li> Orientar as peças para a superfície contendo os corpos de frutificação é perpendicular à superfície da lâmina, e os esporos são disparados ao longo do comprimento da lâmina. </li><li> Colocar a lâmina em uma câmara de umidade durante a noite sob as luzes. Esporos irá acumular sobrea corrediça e ser visível a olho nu na manhã seguinte (Figura 2). </li><li> Esporos acumulados podem ser lavadas para fora do slide com água e quantificados, se desejado. </li><li> Potenciais inibidores de descarga de ascósporos pode ser ensaiada adicionando-os para o lado de trás do bloco de agar durante a montagem do ensaio. Alguns inibidores de canais iónicos que reduzem descarga foram previamente testados com esta técnica 15. </li></ol> 3. Geração de progênie recombinante <ol><li> Iniciado atravessar através da inoculação em ágar cenoura com duas cepas de F. graminearum (um Nit + e um nit-), colocando os pontos de inoculação em lados opostos da placa de Petri. </li><li> Uma vez que as hifas ter enchido a superfície, raspar parte aérea e aplicar Tween-60 solução como acima descrito. Use um marcador notar, no lado da placa de Petri onde as hifas se encontram. </li><li> Voltar culturas à luz e incubar até peritécios têm desenvolvido, e ter barbilhoes serarma para formar a partir do peritécio ao longo da intersecção entre as duas culturas. </li><li> Sob o microscópio de dissecação, pôr em ver a peritécios ao longo da intersecção das duas culturas. Usando um pino de insectos, esterilizados e mergulhado em água estéril, um toque cirrhus ao longo desta fronteira levemente com a ponta do pino. A umidade no pino deve permitir que os cirrhus para manter o pino. </li><li> Lavar a extremidade do pino com os cirrhus sobre ele em 200 uL de água estéril num tubo de Eppendorf para lavar os esporos fora. </li><li> Chama a pino, umedecê-la novamente e escolher outra cirrhus. Escolha 10-15 barbilhoes, e colocar cada em um tubo separado de água. </li><li> Resumidamente tubos vortex contendo suspenso barbilhoes. </li><li> Remover 60 uL da suspensão de esporos com uma pipeta, coloque em MMTS meio 1 em um prato 9 centímetros de Petri. Espalhe com um taco de hóquei estéril. A suspensão de esporos restante pode ser armazenado a 4 ° C durante até uma semana e replated se necessário. </li><li> Incubaçãote à temperatura ambiente (luz não necessário) durante 3-5 dias até as colónias muito pequenas aparecem (Figura 3). Haverá dois tipos de fenótipos entre as colônias. As colônias de nit terá hifas esparsa que as colónias + NIT. Barbilhoes de recombinante peritécios irá mostrar ambos os fenótipos de colônias em proporção aproximadamente igual. Descartar as placas com colônias de apenas um único fenótipo sobre eles. Note que às vezes mais de dois fenótipos resultar devido à segregação de outros fatores. </li><li> Mova colônias de V8 ou ágar cenoura para o armazenamento. Colónias de teste em Agar Czapek Dox (os estirpes nit-não vai crescer em Dox Czapek) e em PDA com clorato (0,5 M clorato de potássio; as estirpes + de nit não vai crescer em PDA com clorato) para confirmar a correcta fenótipo. Examine essas colônias para as qualidades desejadas. </li></ol> 4. Os resultados representativos Produzindo peritécios O objectivo é ter um relvado deperitécios sem qualquer micélios ou esporos aparentes. A superfície da cultura aparecerá semelhante a veludo preto (Figura 1). Aos 24 hr após a aplicação de Tween a superfície do ágar deve ter um ligeiro brilho. Se micélios reaparecer, então a placa não pode ter sido raspada suficiente para induzir o desenvolvimento peritécio. Ascósporos de descarga Sempre fornecer na sua ensaio vários blocos de agar a partir da estirpe de tipo selvagem. Se aqueles que não fazer fogo, em seguida, os peritécios são demasiado jovem ou demasiado velho. Se eles são muito antiga, em seguida hifas numerosos irá aparecer sobre a superfície da cultura dando-lhe uma tonalidade esbranquiçada. Se este não for o caso, eles podem ser muito jovens, e no ensaio deve ser tentada de novo em 24 hr. Ocasionalmente, as culturas não cumprir bem, eo experimento terá que ser repetido. Certifique-se de realizar o ensaio nas condições de luz adequadas. Progênie recombinante <p class="jove_content"&gt; Peritécios recombinante deve fazer a maioria de peritécios ao longo da intersecção entre as duas cepas. Nós geralmente processar 10 barbilhoes a partir de uma cruz e, pelo menos, 4-6 daqueles deve ser recombinante. Muito ocasionalmente, uma mutação impede que uma cepa de acasalamento. Se um dos pais tem um fenótipo de crescimento aberrante, em seguida, mais de 2 fenótipos podem estar presentes entre as colónias em MMTS. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> Figura 1. Estágios de desenvolvimento peritécio em agar de cenoura. H, para a esquerda 72 após a aplicação de Tween. Observação pigmento vermelho e peritécios muito jovem visível como uma grãos negros na superfície. Direito de, a 144 h, peritécios maduros ter se formado. Nota quase completa ausência de micélio superficial em ambas as culturas. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> Figura ensaio de descarga 2.. A ficha de agar de laranja cenoura é orientada de modo thaesporos t forçosamente descarregadas a partir do peritécios maduro na sua superfície podem acumular-se sobre a superfície da lâmina de vidro. 15 hr tempo de acumulação. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> Figura 3. Diferenças de crescimento entre Nit + e-NIT colônias em meio MMTS seletivo. As colónias nit-(pontas de seta) são menores. A NIT + de colônias (setas) mostram um crescimento robusto. Fotografia tirada depois de 7 dias.

<ol><li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li>
<li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuller%2C+AHR+%22Researches+on+Fungi%22">Researches on Fungi</a>. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).</li>
<li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid1%2C+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel%2C+affects+growth%2C+development%2C+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li>
<li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li>
<li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+%28MAT%29+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li>
<li>Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li>
<li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li>
<li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%2C+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li>
<li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes%3A+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li>
<li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+%28Gibberella+fujikuoi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li>
<li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene%2C+ROA%2C+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li>
<li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li>
<li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+cannons%3A+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li>
<li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perithecial+development+by+Gibberella+zeae%3A+a+light+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li>
<li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologica%22%5BJournal%5D)">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

F. graminearum está particularmente bem adaptado para o estudo do desenvolvimento corpo de frutificação, devido à disponibilidade de um genoma bem anotado ( <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> ; 4), e da disponibilidade de uma Affymetrix- baseado microarray 6. Isto facilitou a capacidade de identificar genes importantes para ascósporos descarga 7,11,3. Os métodos apresentados aqui permitirá que o pesquisador se concentrar em um conjunto discreto de estágios de desenvolvimento e funções para a análise genética dos corpos de frutificação de F. graminearum. Os métodos também são facilmente adaptáveis ​​a fungos relacionados que podem ser induzidos a fruta em cultura, e pode ser usado como um padrão para o desenvolvimento de uma variedade de outros tipos de corpo de frutificação fúngicas. A capacidade de avaliar um fenótipo de disparo de esporos podem ser sutis em espécies onde os esporos são pequenos e difíceis de ver, como <em&gt; F. graminearum. A coleção de esporos em uma lâmina limpa facilita a avaliação visual, e avaliação quantitativa, como esporos podem ser lavados fora do slide e quantificada. Algumas espécies de fungos produzir uma mucilagem que rodeia o seu esporo e os esporos não pode ser retirado com água, mas deve ser contados microscopicamente como eles permanecem sobre a lâmina. Nós descobrimos que isso é verdade de Sclerotinia sclerotiorum.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Fusarium graminearum estirpe PH-1 </td><td> Fungal Genetics estoque Center, Kansas </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> Tween 60 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> Agar Czapek Dox do </td><td> Difco, Becton Dickinson </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> Cloreto de Potássio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

desenvolvimento sexual e descarga de ascósporos em fusarium graminearum</em

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum tornou-se um sistema modelo para estudos em desenvolvimento e patogenicidade de fungos filamentosos. F. graminearum mais facilmente produz corpos de frutificação, chamados peritécios, em ágar cenoura. Peritécios conter inúmeros tipos de tecidos, produzidas em fases específicas do desenvolvimento peritécio. Estes incluem (por ordem de aparecimento) a formação de as iniciais peritécio (que dão origem às hifas ascogenous), a parede exterior, paráfise (micélios estéril que ocupam o centro do peritécio até que o ascos desenvolver), o ascos, e os ascósporos dentro do ascos 14. O desenvolvimento de cada um destes tecidos é separado por aproximadamente 24 horas e tem sido a base em estudos transcriptomic durante o desenvolvimento sexual 12,8. Consulte Hallen et al. (2007) para uma descrição mais completa do desenvolvimento, incluindo fotografias de cada etapa. Aqui, apresentamos os métodos para gerar e colher síncronaly desenvolvimento de gramados de peritécios para estudos temporais de regulação gênica, desenvolvimento e processos fisiológicos. Embora estes métodos são escritos especificamente para ser utilizado com F. graminearum, as técnicas podem ser utilizadas para uma variedade de outros fungos, desde que a frutificação pode ser induzida em cultura e há algum sincronia com o desenvolvimento. Recentemente adaptado este protocolo para estudar o desenvolvimento sexual de F. verticillioides. Embora peritécios indivíduo deve ser colhido manualmente nesta espécie, porque um gramado de desenvolver peritécios não poderia ser induzido, o processo funcionou bem para estudar o desenvolvimento (Sikhakolli e Trail, inédito). A função mais importante de corpos de frutificação de fungos é a dispersão de esporos. Em muitas das espécies de Ascomycota (ascus produzindo fungos), os esporos são disparadas a partir do ascus, devido à geração de pressão de turgescência dentro do ascus, dirigindo ejecção de esporos (e fluido epiplasmic) através doporo na ponta ascus 2,7. Nossos estudos de descarga de ascósporos forçada resultaram no desenvolvimento de um &quot;ensaio de descarga de esporos&quot;, que usamos para triagem de mutações no processo. Apresentamos aqui os detalhes deste ensaio. F. graminearum é homothallic e, portanto, pode formar corpos de frutificação, na ausência de um parceiro compatível. A vantagem de homothallism é que atravessamento não é necessária para gerar descendência homozigótica para um traço particular, uma faceta que facilitou o estudo do desenvolvimento sexual nesta espécie 14,7. No entanto, as estirpes heterotálico ter sido gerados que podem ser utilizados para a passagem 5,9. É também possível para atravessar as estirpes homothallic para se obter mutantes para vários genes na estirpe um 1. Isso é feito por coinoculating uma placa de Petri com 2 estirpes. Ao longo do ponto de encontro, a maioria dos peritécios será recombinante (fornecida uma mutação em uma das estirpes-mãe não inibede cruzamento). Com a idade peritécios, eles exalam ascósporos em massa ao invés de descarregá-los à força. O exsudado de esporos resultante (chamado um cirrhus) senta-se a ponta do peritécio e pode ser facilmente removido para a recuperação de esporos individuais. Aqui nós apresentamos um protocolo para facilitar a identificação de recombinante peritécios ea recuperação da progênie recombinante.

Cruzamentos sexuais e isolamento da progênie recombinante são importantes ferramentas de pesquisa para o fungo filamentoso,<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, As técnicas necessárias com sucesso realizar estes processos são apresentados.

Desenvolvimento Sexual e descarga de ascósporos em Fusarium graminearum</em

O *Fusarium graminearum* tornou-se um sistema modelo para estudos sobre o desenvolvimento e a patogenicidade de fungos filamentosos. O *F. graminearum* produz mais facilmente...

O objetivo geral deste procedimento é aprender como gerar e manipular o desenvolvimento de parásias e induzir a liberação de APO em cultura. Isso é realizado primeiramente induzindo e cultivando ativamente para iniciar o desenvolvimento sexual. O segundo passo é realizar um ensaio para detecção de liberação ativa de esporos, seguido pela geração de parásias recombinantes.O passo final consiste em avaliar a prole quanto a fenótipos que indiquem se a recombinação ocorreu ou não. Em última análise, os resultados podem ser utilizados para triagem de mutantes no desenvolvimento sexual ou para gerar múltiplas mutações dentro de uma única linhagem. A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos são difíceis de descrever e, embora simples, devem ser realizados com precisão para obter descarga ideal de esporos e produção consistente de parásia.Inicie inoculando centralmente o meio de agaro de cenoura em uma placa de Petri de seis centímetros com uma linhagem fértil de f. gramine. Incube as placas inoculadas sob luz fluorescente padrão comercial intensa, à temperatura ambiente.Deixe os fungos crescerem por três a cinco dias, até que o micélio tenha atingido a borda externa da placa. No capuz, raspe suavemente a superfície do cultivo com o palito estéril para remover os micélios aéreos.Em seguida, aplique um mililitro de surfactante à broca e esfregue na superfície com a extremidade curvada ou bulbosa de uma haste de vidro estéril. Sem aplicar perfil. Coloque as placas de volta sob as luzes.Após 24 horas, a superfície das placas deve apresentar uma aparência brilhante. Se houver reaparecimento de micélios, raspe novamente a superfície, reaplique a solução de tween 60 e exponha à luz por mais 24 horas. Agora, observe o desenvolvimento da parastesia durante uma semana.Os parásitos jovens são visíveis como grãos pretos na superfície do parafuso sem-fim. Em comparação com os parásitos maduros, deve haver quase nenhuma micélio superficial.No sétimo dia, esporos maduros se acumulam na tampa da placa, e no nono dia, os esporos estão tão densos que são visíveis sem ampliação. Para colher a fase intermediária, parateses raspam suavemente a superfície do parafuso sem-fim com uma lâmina e transferem as parateses para um tubo de criogenização. O tubo pode então ser congelado rapidamente para extração de RNA seis dias após a aplicação do agente tensoativo.Corte um círculo de um centímetro de diâmetro do cilindro com uma broca, furadeira ou bisturi. Corte o círculo ao meio e monte as metades em uma lâmina de microscópio de vidro, orientando os pedaços de modo que a superfície contendo os corpos frutificantes fique perpendicular à superfície da lâmina, e os esporos sejam disparados ao longo do comprimento da lâmina. Neste momento, se desejar aplicar um inibidor de esporos acro, aplique-o na parte traseira do bloco do cilindro.Essa técnica pode ser usada para triar produtos químicos quanto a inibidores da liberação e para triar mutantes genéticos quanto à perda da capacidade de disparar esporos; realizamos com sucesso ambos os testes. Agora, incube a lâmina durante a noite em uma câmara simples iluminada, com temperatura ambiente e umidificada. À medida que os corpos de frutificação eclodem, os esporos se acumulam na lâmina e estarão visíveis ali pela manhã.Os esporos acumulados podem agora ser lavados da lâmina e coletados em um recipiente limpo para quantificação. Comece montando um cruzamento genético entre duas linhagens de f gramine arum, inoculando-as em lados opostos de uma placa de Petri com meio de cenoura. Como descrito anteriormente, cultive os fungos até que as hifas tenham preenchido toda a superfície.Retire as porções aéreas e aplique T entre a solução 60. Nesse cenário, marque a placa onde os hifas se encontram. Retorne as culturas à luz e incube-as por cerca de sete dias, quando a paratelia tiver se desenvolvido e os Siri começarem a se formar a partir da paratelia ao longo da interseção entre as culturas.Essa técnica pode ser usada para combinar múltiplas mutações em uma única linhagem. Vale também ressaltar que tanto knit mais quanto knit menos podem ser selecionados, tornando esse um marcador selecionável muito útil. Sob o microscópio estereoscópico, visualize a parastesia ao longo da interseção das duas culturas.Em seguida, localize o olho sear. Mergulhe então um alfinete para insetos esterilizado em água estéril e toque com o alfinete uma estrutura serosa formada na borda entre as culturas. Os SRI devem aderir à umidade do alfinete.Em seguida, enxágue a ponta do palito em 200 microlitros de água estéril contidos em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Flame o palito, umedeça-o novamente e colete outro sru. Colete entre três e cinco Siri e transfira-os para seus próprios tubos.Agora, agite brevemente em vórtex. Cada tubo contendo Siri em suspensão para cada tubo. Espalhe 60 microlitros da suspensão de esporos em uma placa de Petri de nove milímetros.Com o meio MMTS, incube as placas à temperatura ambiente com ou sem luz, e armazene a suspensão de esporos remanescente a quatro graus Celsius por até uma semana. Após três a cinco dias, aparecem colônias muito pequenas na placa. Um fenótipo pode ser avaliado ao microscópio.As colônias negativas em tricô terão hipó mais escassas do que as colônias positivas em tricô. Descarte as placas que apresentam apenas um dos fenótipos. Os Siri provenientes de parastesia recombinante apresentam ambos os fenótipos de colônia em proporções aproximadamente iguais.Guarde essas placas. Às vezes, outros fenótipos surgem devido à segregação de outros fatores, como colônias, que são intermediárias entre positivas e negativas para tricô, com fins de armazenamento; transfira as colônias das placas recombinantes para uma placa de suco de V eight ou de cenoura para continuar o estudo, examinando outros fenótipos. Plaque as colônias em agare de Chap X dock e em placas com PDA contendo clorato. As parastesias foram cultivadas formando um gramado semelhante a veludo preto, sem hifas ou esporos.24 horas após a aplicação do tween, a superfície da broca apresentava um leve brilho. Se o micélio tivesse reaparecido, a placa talvez não tenha sido raspada o suficiente para induzir o desenvolvimento da parastesia. Vários blocos de broca com corpos de frutificação de uma linhagem selvagem foram montados para liberar seus esporos sobre lâminas de vidro para observação.Preparou-se a iluminação adequada para disparar. Parathesias muito jovens ou muito velhas frequentemente não disparavam. Quando muito velhas, numerosas hifas apareciam sobre a superfície do cultivo, conferindo-lhe uma tonalidade esbranquiçada.Quando muito jovens, os corpos de frutificação não dispararam, e o experimento foi repetido. Vinte e quatro horas depois, quando 10 Siri foram coletados de um cruzamento, pelo menos seis eram tipicamente recombinantes, conforme avaliado por uma mistura de fenótipos negativos e positivos para knit. Muito raramente, uma mutação impedia uma linhagem de se acasalar.Se um dos progenitores apresentava um fenótipo aparente de crescimento, então mais de dois fenótipos estavam presentes entre as colônias em MMTS. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de iniciar com um cultivo que tenha sido bem mantido e não transferido sequencialmente ao longo do tempo. Sempre inicie com um cultivo obtido a partir de uma estirpe estável armazenada em freezer.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Para estudar os processos de desenvolvimento de ascósporos em Gibberella zeae, um procedimento de coleta em condições estéreis é filmado de forma a gerar o maior nível de informação para a descrição do protocolo. Isso deve facilitar a reprodutibilidade do experimento, um aspecto crucial quando completa do genoma testes perfil de expressão são implementadas.

Gibberella zeae produção de ascósporos e Coleta de Experimentos de Microarray.

A devastação das culturas de cereais por fungos que infectam sementes de suscitou numerosos esforços de pesquisa para entender melhor planta-patógeno interações. Para estudar sementes de fungos interações em um ambiente de laboratório, nós desenvolvemos um método robusto para a quantificação de reprodução dos fungos, biomassa e contaminação por micotoxinas utilizando bioensaios de kernel.

Quantificação da colonização fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas Utilizando Bioensaios Kernel

Fornecemos um método básico reprodutível para a microscopia de longo prazo do ciclo de vida sexual da levedura de fissão. Com pequenos ajustes descritos, o protocolo apresentado permite que a pesquisa se concentre em diferentes etapas do processo reprodutivo.

Microscopia de fissão de levedura Ciclo de Vida Sexual

Problemas no processamento de amostras biológicas para observação de microscopia eletrônica de varredura incluem colapso celular, tratamento de amostras de microambientes úmidos e destruição celular. Protocolos de baixo custo e relativamente rápidos, adequados para a preparação de amostras desafiadoras, como meristemas florais, cistos de oomicetos e fungos (Agaricales), são compilados e detalhados aqui.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Aqui apresentamos um protocolo baseado no sistema de isca mealworm (Tenebrio molitor)-isca que foi utilizado para isolar e selecionar fungos entomopatômicos (EPF) a partir de amostras de solo. Uma fórmula eficaz de número de conidia (ECN) é usada para selecionar EPF tolerante ao alto estresse com base em características fisiológicas para controle microbiano de pragas no campo.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Este protocolo é um método eficaz e rápido de cultivo de leveduras e o molde Aspergillus fumigatus de grandes conjuntos de amostras de solo em apenas 7 dias. Os métodos podem ser facilmente modificados para acomodar uma gama de mídias de incubação e temperaturas conforme necessário para experimentos.

Isolamento de Leveduras culturais e moldes de solos para investigar estrutura populacional fúngica

Este manuscrito detalha um protocolo de inoculação otimizado que utiliza bainhas de folhas de milho destacadas para estudos citológicos, fisiológicos e moleculares reprodutíveis de interações do milho com fitopatógenos fúngicos. As bainhas foliares facilitam a observação em tempo real das interações celulares entre a planta viva e o fungo em tecidos não fixos.

Bainhas de milho destacadas para imagens de células vivas da infecção por patógenos fúngicos foliares de milho

Aqui apresentamos um protocolo básico para a indução do acasalamento de P. blakesleeanus .

Cruzamentos sexuais com o mucoromiceto Phycomyces blakesleeanus

Células tumorais mamárias expressar luciferase são implantados subcutaneamente em camundongos e visualizado utilizando imagens ópticas para monitorar o crescimento do tumor e de desenvolvimento não-invasiva em um estudo longitudinal.

In vivo Bioluminescent imagem de tumores mamários Usando Spectrum IVIS

Técnica necessária para visualizar o coração batendo em larvas e...

Visualizar o coração batendo no Drosophila</em

Aprenda a induzir desenvolvimento sexual e descarga de ascósporos em Fusarium graminearum usando ágar de cenoura. Este método permite avaliar progênies recombinantes e rastrear mutantes em reprodução fúngica.

Desenvolvimento Sexual e descarga de ascósporos em Fusarium graminearum

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