Purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi da Hot acquosa-fenolo di estrazione

Summary

Descriviamo una modificato caldo acquosa-fenolo metodo di estrazione per purificare lipopolisaccaride (LPS) da batteri Gram-negativi. Una volta estratto, le LPS può essere successivamente analizzati mediante SDS-PAGE e visualizzati tramite colorazione diretta o immunoblot occidentale.

Abstract

Lipopolisaccaride (LPS) è un componente principale delle membrane batteriche Gram-negativi esterni. Si tratta di una molecola composta dal lipide A, che è incorporato nella membrana esterna, un oligosaccaride e ripetibile nucleo O-antigene unità che si estendono verso l'esterno dalla superficie della cella ^{1, 2.} LPS è una molecola immunodominante che è importante per la virulenza e patogenesi di molte specie batteriche, tra Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Escherichia coli e ^3-5, e le differenze di LPS O-antigene composizione forma la base per la sierotipizzazione di ceppi. LPS è coinvolto in attaccamento alle cellule ospiti all'inizio della infezione e fornisce protezione da complemento-mediata uccisione; ceppi privi LPS può essere attenuato per virulenza ^6-8. Per queste ragioni, è importante visualizzare LPS, in particolare da isolati clinici. LPS visualizzando bande modelli e il riconoscimento da uno specificontibodies possono essere strumenti utili per identificare i lignaggi di deformazione e caratterizzare i vari mutanti.

In questa relazione, si descrive un hot-fenolo acquoso metodo per l'isolamento e la purificazione di LPS da cellule batteriche gram-negativi. Questo protocollo consente l'estrazione di LPS lontano da acidi nucleici e proteine ​​che possono interferire con visualizzazione di LPS che si verifica con brevi e metodi di estrazione meno intensi ^9. LPS preparato in questo modo possono essere separati da sodio dodecil solfato (SDS)-poliacrilammide gel elettroforesi (PAGE) e direttamente colorati usando carboidrati / glicoproteina macchie o normali metodi di colorazione d'argento. Molti anti-sieri di LPS contenere anticorpi che cross-reagiscono con le proteine ​​della membrana esterna o altri bersagli antigenici che possono ostacolare la reattività osservati dopo immunoblot occidentale SDS-PAGE separate da lisati cellulari grezzi. Proteasi trattamento di lisati cellulari grezzi da sola non è sempre un modo efficace per rimuovere questosfondo di utilizzare questo o altri metodi di visualizzazione. Inoltre, il trattamento della proteasi esteso nel tentativo di eliminare questo sfondo può portare a LPS scarsa qualità che non è ben risolto da uno qualsiasi dei metodi summenzionati. Per queste ragioni, riteniamo che il seguente protocollo, adattato da Westpahl Jann e ^10, è l'ideale per l'estrazione LPS.

Protocol

1. Preparazione di batteri per l'estrazione LPS

1. Avviare una cultura pernottamento in 5 ml di Luria Broth (LB), integrato con antibiotici se necessario. Grow coltura durante la notte (12-18 ore) in un incubatore agitazione a 37 ° C e 200 rpm.
2. Diluire il 01:10 cultura con LB e prendere un ₆₀₀ lettura OD in uno spettrofotometro. Sulla base della lettura ₆₀₀ OD, una sospensione 1,5 mL dei batteri ad una OD ₆₀₀ di 0,5.
3. Pellet i batteri in una microcentrifuga a 10.600 xg per 10 minuti. Rimuovere e scartare il surnatante. Il pellet può essere conservato a -20 ° C, se LPS non sta per essere estratto immediatamente.

2. Estrazione di LPS

1. In primo luogo, preparare 2x tampone SDS. Effettuare una soluzione di 50 mL del 4% β-mercaptoetanolo (BME), 4% SDS e 20% glicerolo in 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8. Aggiungere un pizzico di blu di bromofenolo per tingere la soluzione. Fai una SDS-buffer 1x magazzino diluendo 2X stock 1:1 in sterile distillata H ₂ O. Questo può essere conservato a temperatura ambiente.
2. Fare tre distinti a 10 mg / mL soluzioni di DNasi, RNasi e proteinasi K in sterile distillata H ₂ O.
3. Risospendere i batteri pellet a partire dal punto 1,3 in 200 microlitri di 1x SDS-buffer. Assicurarsi che il pellet è completamente risospeso pipettando la soluzione su e giù lentamente. Non vortice.
4. Lessare i batteri in sospensione in un bagnomaria per 15 minuti. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per 15 minuti.
5. Aggiungere 5 microlitri di entrambi I DNasi RNasi e soluzioni preparate in 2.2. Incubare i campioni a 37 ° C per 30 minuti. * Questo passaggio è facoltativo, c'è minima differenza nella qualità di LPS tra campioni nucleasi trattati e non trattati.
6. Aggiungere 10 pl di soluzione di proteinasi K preparata in 2,2. Incubare i campioni a 59 ° C per 3 ore. Questa fase può essere eseguita durante la notte, se ci sono vincoli di tempo.
7. Per ogni annuncio campione,d 200 pl di ghiacciato Tris-fenolo saturo (acqua-fenolo saturo può essere utilizzato come sostituto se Tris-fenolo saturo non è disponibile). Assicurarsi che i tappi sui tubi sono chiuse ermeticamente, e vortex ogni campione per circa 5 a 10 secondi.
8. Incubare i campioni a 65 ° C per 15 minuti, vortex occasionalmente. Dopo incubazione raffreddare a temperatura ambiente, poi aggiungere 1 ml di temperatura ambiente etere dietilico per ciascun campione e vortex per 5 a 10 secondi. Assicurarsi di eseguire etere manico in una cappa aspirante, in quanto è volatile.
9. Centrifugare i campioni a 20600 x g per 10 minuti. Rimuovere con cautela i campioni dalla centrifuga ed estrarre lo strato di fondo blu. Essere sicuri di evitare la parte superiore, strato trasparente. Lasciando una piccola quantità dello strato blu è preferibile contaminazione con lo strato superiore.
10. Ri-estrarre i campioni ripetendo i punti da 2,7-2,9. Due estrazioni sono di solito sufficienti. Se i campioni appaiono nuvoloso, più estrazioni può essere Effettuared. Aggiungere 200 pl di 2x SDS-buffer per ciascuno dei campioni estratti prima separazione mediante SDS-PAGE. I campioni possono essere eseguiti su 8% -15% SDS-poliacrilammide gel. Cinque a quindici microlitri di LPS preparate utilizzando questo metodo è di solito sufficiente per la visualizzazione.

3. Risultati rappresentativi

LPS campioni preparati come sopra può essere visualizzato mediante colorazione diretta dopo la separazione su SDS-PAGE usando uno standard di argento o di un protocollo di colorazione disponibile in commercio kit di colorazione LPS. In alternativa, LPS separati su un gel di poliacrilammide può essere trasferita ad una membrana di nitrocellulosa e sottoposto a Western immunoblotting usando LPS-specifici anti-sieri. Per questo protocollo, abbiamo usato il Pro-Q Emerald 300 Kit Gel Stain Lipopolisaccaride (Molecular Probes), e seguito le istruzioni del produttore.

In figura 1 è una Pro-Q Emerald 300 tinto 12% SDS-gel di poliacrilammide. Ciascuna corsia contiene 15 pl di LPS preparati da DIFdifferenti ceppi di Burkholderia dolosa isolati da campioni di espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica. Differenti modelli di LPS banding scala, riflettenti di numeri diversi O-antigene unità ripetitive attaccato al centro oligosaccaride, sono evidenti con questo metodo, ad esempio, campioni in corsia 1 e 6 sono simili schemi bande tra loro (scatolato in rosso).

Figura 1. Pro-Q Emerald 300 LPS macchiate da Burkholderia dolosa isolati clinici. LPS di sette B. ceppi dolosa di un focolaio in pazienti affetti da fibrosi cistica sono stati isolati come descritto in questo protocollo. Quindici pl sono stati separati su un 12% SDS-gel di poliacrilammide, e colorate con Pro-Q Emerald 300, secondo le istruzioni del produttore. LPS nucleo è indicata una freccia, e LPS che mostrano modelli simili bande di O-antigene ripetizioni sono boxed in rosso. M = marcatore di peso molecolare.

Discussion

Abbiamo descritto un metodo di purificazione LPS lontano dagli altri componenti cellulari, tra cui gli acidi nucleici e proteine. Questo metodo consente di alta qualità LPS che possono essere utilizzati in un certo numero di metodi di visualizzazione differenti, compresa la colorazione carboidrati di SDS-PAGE gel, come mostrato nella Figura 1. Questo metodo può essere utilizzato per sierotipo LPS da una varietà di ceppi, utilizzando specifici anti-sieri, o per mostrare connessione tra isolati tramite visualizzazione diretta. Ad esempio, un recente genome-wide progetto di sequenziamento, in combinazione con la caratterizzazione LPS da un focolaio di B. dolosa portato alla scoperta di un polimorfismo di singolo nucleotide (SNP) correlato alla presenza e assenza di LPS in questi ceppi ^11. Crediamo che questo metodo è preferibile per il trattamento della proteasi di lisati di cellule intere descritti da Hitchcock e Brown ^9, in quanto è relativamente veloce, ma rigoroso sufficiente a produrre alta qualità LPS per analizzare ulteriormentes.

Mentre ci mostra solo un esempio utilizzando la dolosa Burkholderia, questo protocollo può essere adattato ad altri Gram-negativi specie pure. Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per estrarre e visualizzare LPS da altri Burkholderia spp., Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella spp. Se i risultati di protocollo in poca o nessuna resa LPS, potrebbe essere che l'LPS fraziona ad un livello diverso le fasi di estrazione, 2,7-2,9. Per risolvere questo, ripetere il protocollo e salvare un campione di ogni strato durante le fasi di estrazione, questi possono essere visualizzati mediante colorazione uno SDS-PAGE gel al fine di determinare dove il fraziona LPS, e il protocollo può essere modificato di conseguenza. Va inoltre notato che questo protocollo, mentre ideale per scopi analitici, non produce LPS che è appropriato per altre applicazioni, come analisi strutturali.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase I recombinant, RNase-free	Roche Group	04716728001
RNase A	Roche Group	10109169001
Proteinase K	Fisher Scientific	BP1700
Tris-Saturated Phenol	Fisher Scientific	BP1750-100
Diethyl Ether	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Molecular Probes, Life Technologies	P20495