Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do corante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para a identificação e separação de diferentes sub-populações de células em glioblastoma humano com base na frequência de divisão celular.
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Artigo de método
Identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Heterogeneidade tumoral representa uma característica fundamental apoio robustez tumor e apresenta um obstáculo fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas 1. Para superar o problema da heterogeneidade de tumores, que é essencial para desenvolver ensaios e ferramentas que permitam fenotípica, identificação (epi) genéticos e funcionais e caracterização de sub-populações de tumor que conduzem a doenças específicas e patologias representam alvos clinicamente relevantes. Está agora bem estabelecido que os tumores apresentam distintas sub-fracções de células com diferentes frequências de divisão celular, e que os critérios funcionais de ser lento ciclismo está positivamente associado com a capacidade de formação de tumor em vários cancros, incluindo as do cérebro, da mama, pele e pâncreas, bem como leucemia 2-8. O corante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) tem sido utilizado para controlar a frequência de divisão de células, in vitro e in vivo em sangue-carregada tumors e tumores sólidos tais como o glioblastoma 2,7,8. A célula-permeante não fluorescente pró-droga é convertido de CFSE por esterases intracelulares para um composto fluorescente, a qual é retida no interior das células por ligação covalente a proteínas através da reacção da sua porção de succinimidilo com grupos amina intracelulares para formar ligações amida estáveis 9. O corante fluorescente é distribuído igualmente entre as células filhas após divisões, conduzindo à redução para metade da intensidade de fluorescência em cada divisão celular. Isso permite o acompanhamento da freqüência do ciclo celular até 8-10 rodadas de divisão 10. Capacidade de retenção de CFSE foi utilizado com células tumorais do cérebro para identificar e isolar uma subpopulação de ciclismo lenta (topo 5% de retenção de corante de células) demonstraram a ser enriquecida em actividade de células do cancro da haste 2.
Este protocolo descreve a técnica de coloração de células com CFSE e o isolamento de populações individuais dentro de uma cultura de GLIO humanoblastoma (GBM) derivadas de células que possuem taxas de divisão diferentes usando citometria de fluxo 2. A técnica tem servido para identificar e isolar uma população de tumor cerebral ciclismo lenta das células por virtude da sua capacidade para reter a rotulagem CFSE.
Protocolo
1. Preparando Glioblastoma suspensão de célula única
- Cultura Gliomasphere é estabelecido e mantido utilizando o ensaio neuroesfera (NSA), como descrito anteriormente 2,11,12.
- No momento apropriado para as passagens em gliomaspheres, o meio contendo as esferas é removido, colocado num tubo de cultura apropriado tamanho estéril de tecidos, e centrifugadas a 800 rpm (110 g) durante 5 min à temperatura ambiente.
- O sobrenadante é eliminado eo sedimento de esferas é ressuspenso em 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA e incubado a 37 ° C num banho de água durante 3-5 min.
- Um volume igual de inibidor de tripsina de soja é, então,....
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Discussão
Um crescente número de estudos demonstraram a importância de uma lenta dividindo compartimento sub-células de cancro em que contribuem para a formação de tumores e resistência ao tratamento 2-8. Por isso, é crítico para descrever e padronizar os métodos experimentais que permitem o estudo desta subpopulação específica de células ou, mais geralmente para comparar as subpopulações com diferentes taxas de crescimento. Usando CFSE para identificar e isolar sub-fracções de células com base na sua taxa de divisão c.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Centro de Pesquisa da Flórida tumor cerebral, o Preston A. Wells Jr. Centro de Terapia do tumor cerebral e os Institutos Nacionais de Saúde (1R21CA141020-01).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Tipo | Companhia | Número de catálogo |
| NeuroCult Médio NSC Basal (Humana) | Médio | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Suplementos Proliferação (Humana) | Meio suplementado | Stem Cell Technologies | 05753 |
| 0,05% de tripsina-EDTA | Reagente | Gibco | 25300-062 |
| Inibidor de tripsina de soja | Reagente | Sigma | T6522 |
| Penicilina / estreptomicina | Reagente | Gibco | 15140-122 |
| T25 frasco | Cultura de conservação | Nalge Nunc internacional | 136196 |
| T80 frasco | Cultura de conservação | Nalge Nunc internacional | 178905 |
| Tubos de 15 ml | Cultura de conservação | BD Falcon | 352096 |
| Tubos de 50 ml | Cultura de conservação | BD Falcon | 352070 |
| EGF | Fator de crescimento | R & D | 2028-EG |
| CFSE CellTrace Kit Proliferação de Células | Divisão Celular fluorescente Rastreamento Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
Referências
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-....
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Reimpressões e permissões
