Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Resumo

Um método para rapidamente tela voláteis de plantas hospedeiras por medição da resposta electrofisiológica de orangeworm umbigo do adulto ( Amyelois transitella) Antenas com os componentes isolados e misturas através de análise eletroantenográfica é demonstrada.

Resumo

Voláteis de plantas desempenham um papel importante na interação planta-inseto. Insetos herbívoros usar voláteis de plantas, conhecidos como cairomônios, para localizar sua planta hospedeira. ^1,2 Quando uma planta hospedeira é um dano de alimentação importante agronômico mercadoria por pragas de insetos podem causar sérios prejuízos econômicos aos produtores. Por conseguinte, cairomônios pode ser usado como atractivos para atrair ou confundir estes insectos e, assim, oferecem uma alternativa ambientalmente amigável para pesticidas para controlo de insectos. ³ Infelizmente, as plantas podem emitir um vasto número de voláteis com composições diferentes e os rácios de emissões dependentes da fenologia da mercadoria ou a hora do dia. Isto torna a identificação de componentes biologicamente ativos ou misturas de componentes voláteis um processo árduo. Para ajudar a identificar os componentes bioativos de emissões de voláteis de plantas hospedeiras que empregamos o laboratório baseado eletroantenografia bioensaio de triagem (EAG). EAG é uma ferramenta eficaz para avaliar e record eletrofisiologicamente as respostas olfativas de um inseto através de seus receptores antenais. O processo de triagem EAG pode ajudar a reduzir o número de produtos voláteis testados para identificar promissores componentes bioactivos. No entanto, bioensaios EAG apenas fornecer informações sobre a ativação dos receptores. Ele não fornece informações sobre o tipo do comportamento dos insetos do composto provoca, o que poderia ser como um tipo, atrativo repelente ou outra resposta comportamental. Voláteis que desencadeiem uma resposta significativa por EAG, em relação a um controle apropriado positivo, são normalmente tomadas para mais testes de respostas comportamentais da praga. O delineamento experimental apresentado irá detalhar a metodologia empregada para a tela à base de amêndoa voláteis de plantas hospedeiras ^4,5 por medição das respostas eletrofisiológicas antenais de um adulto de insetos pragas umbigo orangeworm (Amyelois transitella) com os componentes isolados e misturas simples de componentes através de EAG bioensaio. O método utiliza dois exantenas cised colocado em um suporte de eletrodo de "garfo". O protocolo demonstrado aqui apresenta uma resposta rápida, o método de alto rendimento padronizado para voláteis de triagem. Cada volátil é a um conjunto de montante, constante como para padronizar o nível de estímulo e, assim, permitir que as respostas antenais para ser indicativo da chemoreceptivity relativa. O controlo negativo ajuda a eliminar a resposta eletrofisiológica para tanto a força de solvente residual e mecânica do sopro. O controlo positivo (neste exemplo acetofenona) é um composto único que provocou uma resposta consistente de macho e fêmea traça umbigo orangeworm (SE). Um padrão semioquímicos adicional que proporciona uma resposta consistente e é utilizado para estudos de bioensaio com a traça Agora o macho é (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, um componente de aldeído a partir da feromona do sexo feminino produzidos. ^6-8

Protocolo

1. Preparação de compostos voláteis detectados a partir da planta hospedeira para EAG Triagem

1. Após a identificação apropriada e de autenticação de todos os voláteis através de GC-MS, executar EAG análise baforada de cada volátil disponível. Triagem inicial pode ser um número idêntico de baixo das respostas antenais (N = 3-5) para cada sexo, a fim de alcançar uma indicação de chemoreceptivity relativa num curto período de tempo (Tabela 1).
2. Prepara-se uma solução de cada volátil a uma concentração de 5 mg / mL em pentano. Firmemente selar e refrigerar a amostra até estar pronto para utilização imediata (por exemplo, acetofenona, densidade = 1,03 g / mL, volume = (0,005 g/1.03 g / mL) × 1,000 = 4,85 uL de acetofenona para um balão volumétrico de 1,0 mL e diluir até 1,0 mL com pentano).
3. Pouco antes de análise EAG, remover os frascos contendo o 5 concentração mg / mL de voláteis a ser testadas e deixa-se aquecer até à temperatura ambiente. Enquanto isso, rotular o número adequado de pipetas Pasteur paracorrelacionam-se com cada volátil a ser testado, e envolva um pequeno pedaço de parafilme (ca. 15 × 15 mm) sobre a ponta da pipeta. Para os iniciais de rastreio 10 pipetas de estímulo (N = 4 para cada sexo masculino e feminino) são carregados no caso de uma preparação de mau ou obstáculo imprevistas.
4. Utilizando um par de pinças, gentilmente dobrar o disco bioensaio para metade, para facilitar a colocação para a pipeta, em seguida, parcialmente colocar o disco dobrada na extremidade mais larga da pipeta de modo que ca. 2-3 milímetros do disco estão expostos. Alinhe as pipetas rotulados e preparado em um suporte de rack.
5. Usando uma pipeta ou uma seringa, de carga de 10 uL (50 ug) de solução volátil para cada disco e permitir que a 2 minutos de passar antes de inserir totalmente discos para a pipeta. Uma vez carregado, imediatamente vedar a extremidade da pipeta com parafilme (ca. 15 × 30 mm). A quantidade de estímulo volátil a ser carregado e inchado provavelmente variar com as espécies insectos.
6. Seguindo o mesmo protocolo descrito acima preparar controles paraincluir em cada análise. Para o controle de carga negativa de 10 uL de apenas pentano em cada disco, espere 2 minutos, coloque na pipeta rotulados, e selo. Para o controle positivo, carregar 10 L (50 mg) para o disco, espere 2 minutos, de carga para a pipeta rotulados, e vedação com parafilme.
7. A viabilidade da preparação de insetos antenal provavelmente irá variar com a espécie, mas descobrimos que Amyelois transitella antenas normalmente permanecer ativo e consistente por mais de 30 minutos após a excisão utilizando o protocolo descrito. Esta quantidade de tempo será geralmente permitir até 4-10 amostras de voláteis a serem avaliadas. A Tabela 2 fornece um exemplo de vezes e sequências.

2. Preparação de antenas de inseto para EAG Bioensaio

1. O foco deste experimento é EAG análise, portanto, o pressuposto de que cada pesquisador terá acesso aos insetos devidamente criados.
2. Para esta experiência, vamos estar estudando 3-4 dias old, acasaladas mariposas machos e fêmeas. Traças individuais são transferidos para um pequeno, o recipiente, com tampa de plástico no dia da análise. Imediatamente antes do bioensaio, a traça a ser testado é transferido de cabeça em um aparelho de fixação (isto é, feito a partir de várias pontas pipetadores de plástico) e protegido por trás. A manipulação do inseto pode ser visto sob um baixo consumo de energia estereomicroscópio para facilitar a excisão.
3. Antenas são esmiuçadas por meio de uma ferramenta fio de ponta. O titular da forquilha, com uma película pequena de gel de eléctrodo, é colocado em estreita proximidade para a transferência rápida de antenas. A primeira antena é excisado utilizando tesouras micro e colocado no garfo, assegurando a base da antena é colocada sobre a porção não-vermelho do garfo (o eléctrodo de terra indiferente). Um conjunto temporizador durante 10 minutos e é iniciado o segunda antena é excisado e colocado ao lado da primeira antena com ambas as bases do mesmo lado da forquilha.
4. Alternativamente, as antenas podem ser deixados segura dentro do holdintubo g, excisadas, em seguida, removido gentilmente entre o tubo eo insecto usando uma ferramenta de fio de ponta com um pouco de gel na extremidade.
5. Antenas são verificados para garantir a base e da ponta estão imersos em gel de eléctrodo e sem bolhas estão presentes no gel. As extremidades / dicas pode ser cortado para garantir a plena exposição ao gel do eletrodo. Cuidado deve ser usado para assegurar que o resto de cada antena não é coberta com gel, garantindo assim máxima superfície antenal é exposto para o sopro.
6. O garfo preparado é então inserido na sonda pré-amplificador e mantidos sob um fluxo constante de ar humidificado a 200 mL / min para o tempo remanescente do minutos de período de espera 10. O tempo de consumo e EAG vezes de iniciação são anotados (Tabela 2) e 30 segundos antes da baforada primeiro estímulo, a pipeta contendo o controlo positivo é selada e colocada no suporte que é ajustado para dirigir ar / baforada de fluxo 2-3 mm a partir de o preparado antenas.
7. Após cada experiment, as traças de teste são sacrificados em um ambiente de gelo seco e devidamente eliminados.
8. Mariposas fêmeas são dissecados para verificar o status de acasalamento. Machos que coabitam Supõe-se que acasalaram.

3. EAG Protocolo para os componentes individuais

1. Respostas antenais são registados através do software AutoSpike incluídos com o instrumento EAG Syntech. A configuração na guia Propriedades AutoSpike para o canal com a sonda EAG é fixado em uma taxa de amostragem de 106,7, NO para corrigir, e um filtro de 0-42 Hz. Para a guia Filtro, o filtro EAG é ON eo corte baixa é definida a 0,1 Hz.
2. Puffs estímulo são 1-2 segundos de duração. Um timer de 1 minuto é iniciado após cada baforada.
3. A pipeta próximo teste volátil é selada e colocada no suporte. A sequência de voláteis de ensaio, ao acaso entre corre para garantir que não há compostos de teste de forma consistente seguir outro teste volátil, é seguida (por exemplo, Tabela 2) cuidadosamente allowing 1 minuto entre baforadas.
4. Para facilitar a facilidade de leitura respostas EAG, porções de réguas são colocados no ecrã do computador eo nível de linha de base para o ápice do sinal de deflexão para baixo é medido em milímetros e registados numa folha de dados (isto é, para a configuração de 5 mV, 33 milímetros = 2,5 mV). O software tem a capacidade de reprodução das gravações guardadas para análise futura. Conversão de milímetro, quer mV ou amplitude mV é realizada na análise de dados mais tarde.
5. Após a baforada final de controlo positivo (por exemplo, gravar # 12) é administrado, as antenas são removidos, o garfo é limpo com uma limpe-etanol saturado e deixada a secar antes de utilização posterior.
6. Para aumentar o rendimento dos ensaios, a excisão do próximo conjunto de antenas pode ser iniciado por um técnico de laboratório segundo cerca de 10 minutos antes do final do experimento atual - após o sopro quarto, o segundo teste volátil do experimento atual, conforme tabela 2. Isto irá permitir que for do início da experiência seguinte directamente após as extremidades experimentais correntes.
7. Maior número de repetições (em antenas diferentes) pode ser realizada em compostos de interesse para proporcionar maior validação estatística.

4. Um Exemplo de Análise EAG de Blends ou outras matrizes (Tabela 3)

1. Em seguida, as proporções e os volumes de duas misturas terciária (3-misturas de componentes) são calculadas para fornecer um exemplo de combinar os voláteis eliciar respostas EAG elevada (Tabela 4). Os cálculos são para algumas proporções de base, uma razão 1:1:1 molar de α-humuleno: 2-undecanona: 2-feniletanol e comparando a uma proporção de mistura de segunda 01:02:04.
2. Utilizando protocolos similares descrito anteriormente, as misturas são preparadas e rotuladas pipetas de Pasteur são carregados, juntamente com os controlos necessários positivos e negativos.
3. As amostras voláteis são soprados através de antenas características de macho e fêmea, e as respostas são medidos e registrados ema uma folha de dados (Tabela 3).

5. Os resultados representativos

Para orangeworm umbigo feminino as seguintes definições são usadas: 2 puffs segundo, 10 vezes, 10 segundos de gravação segunda janela, e 5 da escala mV. A deflexão negativa é a resposta típica, ainda que o valor absoluto é gravado (por exemplo, -3400 mV deflexão é gravado como 3.400 mV). Uma resposta relativamente fraca da prep para o controlo positivo é descartado. A Figura 1 fornece uma representação gráfica de uma resposta fraca à do controlo positivo por orangeworm umbigo.

Por exemplo de um resultado de controlo pobre, a resposta fêmea média da antena para acetofenona é tipicamente ca. 2600 mV (Figura 2), se a preparação só deu uma resposta de ca. 1300 mV seria descartado e um outro par de antenas preparado. Da mesma forma, a resposta média do sexo masculino a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal foi typically 3000 mV, assim, qualquer resposta inferior a 1500 mV foi tipicamente descartado.

O controlo positivo, no início e no fim de cada experiência também fornece informações acerca da condição das antenas. Uma regra de ouro que seguimos para a verificação rápida é se a resposta da antena para o sopro da pós-controle (registro # 12, Tabela 2) ou é inferior a 75% do sopro 1 ^º do controle pré-(registro # 1 , Tabela 2) ou menos do que a baforada ^nd 2 do controlo de pré-(Pormenores # 2, Tabela 2), em seguida, a experiência não é usado na análise de dados devido a possível degradação da prep (Figura 3). Um exemplo da primeira regra de ouro seria registro # 1 = 2730 mV e registro # 12 = 1680 mV; ea segunda regra de ouro se o registro # 2 = 2350 mV e registro # 12 = 1680 mV, Em cada um desses casos , os resultados de preparação e experimentação, seriam eliminados.

Aexemplo representativo de corrigir os valores de resposta EAG como medidos para o controlo positivo seria como se segue.

Executar #	EAG (mV)	Executar # 2	EAG (mV)	Executar # 3	EAG (mV)
(+) Ctrl	2800	(+) Ctrl	2420	(+) Ctrl	3030
A Cmpnd	3000	A Cmpnd	2500	A Cmpnd	3440
(-) Ctrl	530	(-) Ctrl	755	(-) Ctrl	910
Cmpnd B	2400	Cmpnd B	2000	Cmpnd B	2560
(+) Ctrl	2770	(+) Ctrl	2400	(+) Ctrl	3020

Utilizando os valores acima para uma N = 3 experiência, a resposta de controlo negativo é subtraído de cada valor dentro de cada experimento sob a suposição de controlo negativo é a resposta de linha de base da antena para a baforada mecânica e de solvente residual.

Executar # 1	EAG (mV)	Executar # 2	EAG (mV)	Executar # 3	EAG (mV)
(+) Ctrl	2270	(+) Ctrl	1665	(+) Ctrl	2120
A Cmpnd	2470	A Cmpnd	1745	A Cmpnd	2530
(-) Ctrl	0	(-) Ctrl	0	(-) Ctrl	0
Cmpnd B	1870	Cmpnd B	1245	Cmpnd B	1650
(+) Ctrl	2240	(+) Ctrl	1645	(+) Ctrl	2110

Os controles positivos para cada experimento seria, então, em média e corrigidos a 1.000 mV, observando a relação para a correção para 1.000 mV. Uma folha de dados (por exemplo, Excel) pode ser facilmente manipulado para converter as respostas aos dados utilizáveis.

Executar # 1	Médio (mV)	Executar # 2	Médio (mV)	Executar # 3	Médio (mV)
(+) Ctrl	2255	(+) Ctrl	1655	(+) Ctrl	2115
(+) Ctrl adj.	1000 (0.443)	(+) Ctrl adj.	1000 (0.604)	(+) Ctrl adj.	1000 (0.473)

Multiplicando pelo rácio de correcção dentro de cada experiência, os valores para o composto A e composto B são então ajustados.

Executar # 1	Adj. EAG (mV)	Executar # 2	Adj. EAG (mV)	Executar # 3	Adj. EAG (mV)
A Cmpnd	1094	A Cmpnd	1054	A Cmpnd	1197
Cmpnd B	828	Cmpnd B	752	Cmpnd B	780

As médias (meios) para cada composto são então determinada, juntamente com outros dados estatísticos relevantes e as respostas EAG para os compostos testados pode então ser avaliadopara a candidatura para mais investigações.

Composto	EAG (mV)	Não. Funciona, N =
A	1115	3
B	787	3

Figura 1. EAG representativas para a resposta antenal do sexo masculino (1180 mV) para o controlo de pré-(1 ^r baforada controle positivo) que seria descartado devido à resposta antenal pobre depois de assegurar as antenas têm um bom contacto com o gel. Barras azuis nas janelas inferiores representam o sopro de duas segundo volátil. Clique aqui para ver maior figura .

trong> Figura 2. EAG Representante para a resposta do sexo feminino antenal (3.400 mV) para o 1 ^º sopro de pré-controle, que seria considerado adequado. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3. EAG Representante para a resposta do sexo feminino antenal (1.680 mV) para o posto de controle (controle positivo anterior para cada experimento) que possa ser considerada pobre, e sugestivo de antenas de degradação (<75% de 1 ^º de controle pré-ou < 2 ^nd valor sopro de pré-controle). Para este exemplo o 1 ^º sopro de pré-controle foi 2.730 mV e ² º controle pré-sopro foi 2.350 mV. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 4. Representativas EAG para a resposta feminina antenal (mV 3800) para a baforada de uma mistura candidata volátil e as medições subsequentes do deflexão máxima inicial (mV 3800), a inclinação inicial durante a duração de sopro (0,3 s/1.2 mV = 0,25 s / mV), ea inclinação para a duração de sopro remanescente (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). para ver figura maior .

Figura 5. Vaso pequeno modificado contendo uma matriz de amostra e os voláteis associados a ser soprado através A. transitella antenas.

Tabela 1. SITU emissão volátil de amêndoas nonpareil (2007) e as respostas EAG determinados por uma configuração diferente e menos sensível no programa Autospike.

Tabela 2. Exemplo de uma forma para a gravação do sexo masculino e feminino respostas antenais para individuais componentes voláteis.

Tabela 3. Exemplo de uma forma para a gravação do sexo masculino e feminino respostas antenais a misturas voláteis e / ou bouquets.

Tabela 4. Exemplos de preparação de 10 mL de uma dose de 5 mg / ml de solução para duas diferentes proporções de misturas.

Tabela 5. Exemplo de formulário para gravar duas conseqüênciaspuffs cutive de simples componentes voláteis através de antenas características de macho e fêmea.

Discussão

Uso dos registos eletroantenogramas como um bioensaio para determinar as respostas quimiorecepção de um insecto alvo é bastante comum e numerosos estudos utilizando EAG como um detector para efluente de um cromatograma de gás (GC-EAD) podem ser encontradas na literatura. ^9,10 O método demonstrado proporcionará uma triagem rápida de quantidades equivalentes de componentes voláteis, com repetições elevadas para atribuição confiante da capacidade de resposta relativa. O programa AutoSpike no software Syntech é u...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Acetofenona	Alfa-Aesar	A12727	Controle positivo Feminino
(Z, Z) -11,13-hexadecadienal	Suterra		Controle positivo Masculino
α-humuleno	Aldrich	53675	Sesquiterpeno
2-undecanona	Aldrich	U1303	Derivado de ácido graxo
2-feniletanol	Aldrich	77861	Benzenóide
Pentano	EMD	PX0167-1	Solvente
4-Channel controlador de aquisição	Syntech	EuDAC-4
EAG sonda, pré-amplificador	Syntech	Tipo PRG-2
Titular Antena	Syntech	Para PRG-2	Eletrodo de Fork
Controlador de estímulo	Syntech	CS-55	O fluxo de ar e puffs
Gel Eletrodo Spectra	Parker	12-02
Discos de bioensaios	Whatman	2017-006	6 milímetros
Pipetas Pasteur	VWR	14673-010	5 ¾ "(14,6 cm)
Parafilm M	Bemis	PM-992