Artigo de método

A fase líquida ensaio de captura de afinidade usando pérolas magnéticas para estudar interação proteína-proteína: O Exemplo Poliovírus Nanobody-

DOI:

10.3791/3937

29 de maio de 2012

Neste artigo

Resumo

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Neste artigo, um simples, quantitativa, na fase líquida ensaio de captura de afinidade é apresentado. É uma técnica fiável baseada na interacção entre as esferas magnéticas e proteínas marcadas (por exemplo, nanocorpos), por um lado ea afinidade entre a proteína marcada e uma proteína, segundo rotulada (por exemplo, poliovírus) sobre o outro.

Resumo

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Neste artigo, um simples, quantitativa, na fase líquida ensaio de captura de afinidade é apresentado. Desde que uma proteína pode ser marcado e uma outra proteína marcada, este método pode ser implementado para a investigação de interacções proteína-proteína. Baseia-se, por um lado, sobre o reconhecimento da proteína etiquetada por cobalto esferas magnéticas revestidas e, por outro lado sobre a interacção entre a proteína marcada e uma segunda proteína específica que é rotulado. Primeiro, as proteínas marcadas e marcou são misturados e incubados à temperatura ambiente. As esferas magnéticas, que reconhecem a etiqueta, são adicionados ea fracção ligada de proteína marcada é separada da fracção não ligada usando magnetos. A quantidade de proteína marcada que é capturada pode ser determinada de uma forma indirecta, medindo o sinal da proteína marcada permaneceu na fracção não ligada. O líquido descrito ensaio de afinidade de fase é extremamente útil quando as proteínas de conversão conformacionais sensíveis são assAyed. O desenvolvimento e aplicação do ensaio é demonstrado para a interacção entre o poliovírus e poliovírus reconhecendo nanocorpos 1. Uma vez que o poliovírus é sensível a conversão conformacional 2, quando ligado a uma superfície sólida (resultados não publicados), o uso de ELISA é limitada e um sistema de fase líquida baseada deve, portanto, ser preferido. Um exemplo de um sistema de fase líquida baseada em muitas vezes utilizado em polioresearch 3,4 é a proteína de micro-ensaio de imunoprecipitação Uma 5. Embora este teste demonstrou a sua aplicabilidade, requer uma Fc-estrutura, que está ausente nas nanocorpos 6,7. No entanto, como uma nova oportunidade, estes interessantes e estável anticorpos de domínio único 8 pode ser facilmente fabricado de acordo com marcas diferentes. O amplamente utilizado (His) 6-tag mostra afinidade para os iões bivalentes, tais como níquel ou cobalto, que pode por sua vez ser facilmente revestidos sobre as esferas magnéticas. Por isso, desenvolvemos este quantitativa simplesensaio de captura de afinidade com base em cobalto esferas magnéticas revestidas. Poliovírus foi marcada com 35 S, para permitir a interacção com as desimpedido nanocorpos e para fazer uma detecção quantitativa viável. O método é fácil de realizar e pode ser estabelecida com um baixo custo, que é ainda apoiada pela possibilidade de forma eficaz em regeneração das pérolas magnéticas.

Protocolo

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O princípio (A) e uma visão geral do método (B) estão representados na Figura 1.

1. Preparação do tampão

  1. Preparar Binding / tampão de lavagem por dissolução de dihidrogenofosfato de sódio (50 mM) e cloreto de sódio (300 mM) em água e ajustar o pH a 8,0. Além disso adicionar Tween 20 (0,01% (m / v) de concentração final), metionina (2% (m / v) de concentração final) e albumina (0,1% (m / v) de concentração final) e ajusta-se o volume requerido.

2. Preparação dos grânulos magnéticos

Preparar as esferas magnéticas de acordo com o manual de instruções. R....

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Discussão

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No protocolo, a radioactividade do antigénio interagir com o Nanobody é definida como a perda de vírus radiomarcado a partir do sobrenadante. Por conseguinte, a quantidade de radioactividade precipitado (= 100 - uma%) (ligado às esferas magnéticas) pode ser estimada de forma indirecta pela radioactividade no sobrenadante (=% a). Por outro lado, também é possível medir a radioactividade da fracção precipitada consolidado de antigénio de uma forma directa por eluição dos imunocomplexos a partir das esferas magnéticas com .......

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Divulgações

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Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

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Os autores agradecem à equipe do departamento de Biotecnologia Farmacêutica e Biologia Molecular e, especialmente, Monique De Pelsmacker para a preparação do vírus radioactivas. Somos gratos a Ellen Merckx e Halewyck Hadewych para suas observações e discussões interessantes e Gerrit De Bleeser por sua ajuda no laboratório. Este trabalho foi financiado por uma bolsa OZR da Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), o Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) ea Organização Mundial de Saúde (TSA 200410791). Lise Schotte é um companheiro predoctoral do Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).

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Materiais

Nome do reagente Empresa Número de catálogo Comentários

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dynabeads Isolamento Seu-Tag e Pulldown Invitrogen 101.03D Esferas magnéticas
Optiphase 'HiSafe' 2 Perkin Elmer 1200 - 436 Fluido de cintilação

Referências

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  1. Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
  2. Meloen, R. H., Briaire, J.

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Reimpressões e permissões

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Etiquetas

Cobalt Coated BeadsRadio Labeled ProteinsBinding BufferBead RegenerationUnbound Fraction MeasurementSolid Phase Limitation

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