Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

Summary

Um fluxo de trabalho simplificado para estudar a metilação do DNA e alterações de expressão gênica em início de vida estresse é mostrado. A partir de separação materno de ratos recém-nascidos e isolamento de tecidos cerebrais discretas, que representam um protocolo para simultaneamente isolar DNA e RNA de punções de tecido cerebral para a sequenciação bissulfito subsequente e RT-PCR.

Abstract

A exposição a dieta, medicamentos e adversidades primeiros anos de vida durante as janelas de ^1,2 sensíveis vida pode levar a mudanças duradouras na expressão de genes que contribuem para a exibição de fenótipos fisiológicos e comportamentais. Programação ambiental, é susceptível de aumentar a susceptibilidade a doenças metabólicas, cardiovasculares e mentais ^3,4.

Metilação do DNA e modificações de histonas são considerados processos-chave na mediação do diálogo gene-ambiente e aparecem também para calçar programação ambiental ^5. Nos mamíferos, a metilação de DNA compreende tipicamente a adição covalente de um grupo metilo na posição 5 de citosina dentro do contexto de dinucleótidos CpG.

Metilação de CpG ocorre de uma forma de tecidos e de células-específica altamente tornando-se um desafio para estudar discretas, pequenas regiões do cérebro onde heterogeneidade celular é elevada ea quantidade de tecido limitada. Além disso, ba expressão do gene omo e metilação estão intimamente ligados eventos, o valor aumentado pode ser obtida por comparação entre os dois parâmetros na mesma amostra.

Aqui, um protocolo de passo-a-passo (Figura 1) para a investigação de programação epigenética no cérebro é apresentada usando o paradigma 'separação materna' da adversidade vida precoce para fins ilustrativos. O protocolo descreve a preparação de micropunches de cérebros de rato diferencialmente-idade a partir do qual DNA e RNA podem ser simultaneamente isolados, permitindo assim que a metilação do DNA e as análises de expressão de genes na mesma amostra.

Protocol

1. Programação por Adversidade Infância

Separação materna (SM) é realizada para induzir no início da vida estresse (ELS) em filhotes entregues por ratos timed-grávidas C57BL/6N (dia pós-natal 0 (P0) no dia de nascimento).

1. Ninhadas individuais são colocados em gaiolas limpas (com almofada de aquecimento) durante 3 h diária de P1-10.
2. Controle (não-ELS) filhotes permanecem no ninho imperturbado materna em todo.
3. Os filhotes são mantidos com suas mães até o desmame (P21), após o que eles estão alojados em grupos sexo-combinados (3-5 ratos por gaiola) sob condições de habitação padrão de laboratório com animais.

2. Isolamento e Dissecção do Tecido Cerebral

1. Ratos são mortos em idades desejadas por Nota cervical deslocamento:. Porque este protocolo envolve um paradigma stress, sem anestesia é dada antes de deslocamento cervical, para evitar interferências com regulação fisiológica normal de hormônios do estresse. Crânios são abertos ecérebros são removidos cuidadosamente e imediatamente snap-congelados por imersão em gelo iso-pentano-seca, antes de ser armazenado a -80 ° C.
2. Os cérebros são cryosectioned (10 espessura mm); secções são montadas em lâminas de vidro SuperFrost e mantida a -20 ° C. Referência a um padrão rato estereotáxico atlas (por exemplo, Paxinos ⁶⁾ é utilizado para verificar a precisão anatómica e garantir a inclusão da região de interesse (por exemplo, para os neurónios no núcleo paraventricular - PVN - recolher a partir de secções do nível do PVN rostral, bregma -0,75 a -0,85).
3. As secções são coradas com violeta de cresilo para facilitar a identificação de estruturas diferentes do cérebro. Perfuradores (0,8 mm) das regiões de interesse (por exemplo, NPV) são obtidos por em microdissecação loco.

3. Extração de Ácido Nucleico de socos do cérebro

Um protocolo otimizado para extração simultânea de DNA e RNA de pequena neuroanatomicamente definido cérebro regiões para as análises de expressão bissulfito e gene está descrita ^7.

Nota: Considerando que o RNA é menos estável do que o DNA no tampão-GTC, é recomendável o processamento de RNA em primeiro lugar. O homogenato utilizada para a purificação de ADN pode ser mantida à temperatura ambiente (RT) durante esse tempo.

1. Homogeneizar socos usando uma pipeta e vortexer em 400 uL de tampão de tiocianato de guanidina (GTC) (4,5 M de tiocianato de guanidínio, 2% de N-lauroylsarcosine, 50 mM de EDTA pH 8,25 mM de Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-mercaptoetanol, 0,2% antiespumante A) à RT, passando várias vezes através de uma seringa hipodérmica (29G) (Figura 2).
2. Dividir lisado em partes iguais; RNA e DNA pode ser extraído, ao mesmo tempo ou separadamente, dependendo das necessidades particulares experimentais.
3. Para a purificação de ARN adicionar volume 1/10 de NaOAc, 1 AquaPhenol volume (Appligene) (pH 4) e 1/2 volume de clorofórmio: isoamílico (24:1) para lisado. Vortex vigorosamente depois de cada passo eincubar em gelo durante 10 min, de centrifugação (20 min a 10.000 g, a 4 ° C); adicionar um volume igual de EtOH 70% a fase aequous.
4. Transfira a mistura para uma coluna de spin de RNA (por exemplo, Nucleospin II a partir de RNA Macherey-Nagel) e executar os passos em coluna de DNase-digestão e lavagem (seguir o protocolo do fabricante); eluir RNA em 25 uL _de H2O
5. Para a purificação do DNA de um protocolo otimizado do Sangue DNeasy Qiagen e Kit tecido é usado. Equilibre lisado com volumes iguais de tampão de AL e EtOH a 100%, carga sobre uma centrífuga colunas de giro (1 min a 10.000 g, à RT) e descarte flow-through.
6. Adicionar 500 ul tampão AW1 incluindo 5 ul de RNAse (1 mg / ml) à coluna e incubar 10 min à TA. De rotação (1 min a 10.000 g, RT) e descartar flow-through.
7. Lavar a coluna com 500 AW2 Tampão ul, descartar flow-through e centrifuga coluna vazia (1 min a 15.000 g).
8. Adicionar pré-aquecido (70 ° C) Tampão de AE ​​e colunas incubar durante 10 min a 70 ° C. Eluir por centrifugação (1 min, 10.000 g), re-aplicar flow-through e repetir o passo de centrifugação.

Utilizar um espectrofotómetro para determinar as concentrações de DNA e RNA. Um típico soco PVN rendimentos ~ 600 ng de DNA e ~ 400 ng de RNA. Para a análise de expressão do gene por PCR quantitativo (qPCR), que usam tipicamente ~ 100 ng de RNA na reacção de transcrição reversa.

4. Conversão Bissulfito

Bissulfito de sódio é usado para converter não-metilados citosinas para uracilos. Em contraste, citosinas metiladas são protegidos de conversão. Portanto, todos os citosinas que são detectados no sequenciamento final do bissulfito de PCR-amplicon representam citosinas metiladas.

Bissulfito de conversão provoca a degradação do DNA substancial que pode ser um fator limitante na análise de PCR. Condições de reacção optimizados que maximizam a conversão citosina, reduzir a fragmentação de ADN e manter single-stranded DNA mesmo a temperaturas mais baixas pode ser conseguido usandoKit Qiagen do Bissulfito EpiTect. Nas nossas mãos ~ 200 ng de ADN purificado a partir de micropunches fornecer uma quantidade suficiente de material de partida para a reacção de bissulfito.

Para evitar que as diferenças na eficiência da reacção de conversão, a quantidade de ADN molde deverá ser mantida constante entre todas as amostras processadas durante uma experiência. Além disso, a sequência lê deve ser examinada para a eficiência de conversão através da análise da taxa de não-convertidos não-CpGs. Esta taxa deve exceder 98%. Os valores mais baixos indicam conversão incompleta ou bissulfito ineficiente e as sequências subjacentes devem ser excluídos da análise.

5. PCR bissulfito

1. Bissulfito projeto de seqüenciamento primers específicos para DNA bissulfito convertidos (ver discussão); Primer Metil expresso de software ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ Pt / EUA / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 & catid = 602.121) vai ajudar esta e ajudar a determinar ótimas temperaturas de recozimento em experiências-piloto.
2. Preparar PCR-Master-Mix (para uma reacção) como se segue:

   2,5 ul de tampão de PCR 10x
   0,5 ul de 10 mM de dNTPs
   1 ml de 10 mM de primers para a frente
   1 uL 10 iniciador reverso iM
   0,125 ul Qiagen HotStart Taq Mais
   encher até 23 ul _com H2O

3. Adicionar 2 DNA tratado com bissulfito uL de reacção.
4. Amplificar usando as seguintes condições:

   1 ciclo 6 min 95 ° C
   45-50 ciclos de 1 min 95 ° C, 1 min à temperatura de recozimento óptima, 1 min a 72 ° C
   1 ciclo de 5 min 72 ° C

Analise 7 uL de produto de PCR por electroforese em gel de agarose para verificar o tamanho do fragmento amplificado e purificar restante reacção de PCR para a ligação subsequente utilizando um kit comercialmente disponível PCR clean-up (por exemplo, Macherey-Nagel Nucleospin Extrair). No caso de produtos indesejados de PCR adicionais são obtidos, purificação em gel é recomendado.

6. Seqüenciamento Bissulfito

De alta resolução perfis de metilação deduzidas a partir de leituras único clone pode detectar pequenas alterações na metilação do DNA e identificar regiões regulatórias que respondam ao tratamento (programação ambiental). O processo de seqüenciamento bissulfito compreende três etapas consecutivas de trabalho. Em primeiro lugar, os produtos de PCR obtidos por antes bissulfito de PCR são ligados num vector e transformado em bactérias. Em segundo lugar, a colónia de PCR a partir de clones individuais é empregue para determinar o tamanho correcto da inserção. Em terceiro lugar, PCRs de colônias positivas são limpos e submetidos a Big-Dye reação de seqüenciamento. Após um passo de limpeza, os produtos são a electroforese em um sequenciador capilar.

6,1 Ligadura e Transformação

Nota: Nós rotineiramente usar o pGEM-T vector cloning kit (Promega). Em nossa experiência, a eficiência da clonagem depende criticamente sobre a inserção de ser ligado. Vectores diferentes devem ser testados em caso baixos números de clones recombinantes são repetidamente obtido.

1. Configure reacção de ligação:

   5 tampão de ligação ul 2x
   1 ml pGEM-T Vector
   1 uL de T4-ligase
   3 ul limpo, por produto de PCR

2. Mistura de reacção por pipetagem e incubar durante a noite a 4 ° C.

   Nota: A ligadura pode também ser realizada durante 1 h à RT, bem. Para aumentar o número de clones recombinantes, sobre a ligadura noite a 4 ° C é preferido.

3. Limpe-up de produtos de ligação por precipitação com etanol:
   1. Adicionar 1 glicogénio uL, 1 ul 3M NaAc e 25 ul de EtOH a 100% para a reacção de ligação com o precipitado durante 1 min em azoto líquido.
   2. Centrifugar (15,0000 g durante 30 min a 4 ° C) e descartar o sobrenadante.
   3. Lava-se com 300 uLEtOH 70% e de centrifugação (15.000 g durante 20 min a 4 ° C), descarte pelete sobrenadante e seca à temperatura ambiente (10 min).
   4. Ressuspender o granulado em 10 uL _de H2O

6,2 Transformação de produtos de ligação em bactérias electrocompetentes

1. Cuvetes precool electroporação (1 mm de largura) sobre gelo e descongelamento alíquota de electrocompetentes bactérias DH5a em gelo.
2. Adicionar 45 ul de bactérias DH5a para 10 uL limparam produto de ligação (ver acima) e transferir para cuvete.
3. Transformar bactérias a 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF e adicionar 1 ml de meio SOB pré-aquecido diretamente após a entrega de pulso.
4. Recuperar as bactérias durante 1 h, a 37 ° C, espalhar 100 ul de suspensão sobre placas de LB / ampicilina revestidas com IPTG / X-Gal.
5. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.

6,3 Colony PCR

Nota: Colony PCR a partir de clones individuais é conduzida para assegurar que as inserções sãode tamanho previsto. O desenvolvimento da coloração da seleção azul / branco, eventos de recombinação indesejáveis ​​durante a ligação, a incorporação de pares de primers oligoméricos ou produtos truncados PCR pode levar a resultados de outra forma de sequenciamento defeituosos. Nós usam rotineiramente T7 e SP6 primers para amplificar insere clonados; essa abordagem resulta em seqüências do vetor adicionais de aproximadamente 150 pb. Iniciador T7 é utilizado na reacção de sequenciação num passo posterior.

1. Configurar reacção de PCR em colónias placa de 96 poços. Para uma reação de usar:

   3 ul 2,5 _mM de MgCl2
   2,5 ul de tampão Taq 10x
   1,5 mM dNTP 10 ul
   2 uL 2,5 mM iniciador T7
   2 uL 2,5 mM SP6 iniciador
   1 uL Fermentas Polimerase Taq
   encher até 25 ul _com H2O

2. Pipetar 25 uL / ​​poço de mistura principal em cada poço de uma placa de 96 poços.
3. Escolha clone (branco) positivo de placa com pipeta de ponta e mergulho na reação de PCR.
4. Amplificar usando folguintes condições:

   1 ciclo de 4 min a 95 ° C
   10 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 s, a 56 ° C e 30 s, a 72 ° C
   30 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 s, a 48 ° C e 30 s, a 72 ° C
   1 ciclo de 5 min a 72 ° C

5. Carregar 5 uL de colónia de PCR num gel de agarose e determinar as reacções que contêm o tamanho da pastilha a direita.
6. PCRs Colony contendo os amplicões desejados são limpas utilizando um kit comercialmente disponível (Machery Nagel Nucleofast).

6,4 Big-Dye terminator reação e seqüenciamento

1. Prepare Mix Master para Big-Dye reação. Para uma reação de usar:

   1 uL _de H2O
   0,5 reagente Big Dye-ul
   1,5 ul de tampão de Seqüenciamento

2. Pipetar 3 uL / ​​poço em cada poço de uma placa de 96 poços, a cada poço adicionar 2 ul de produto limpo colónia PCR e executar reacção num termociclador com os seguintes parâmetros:
   35 ciclos de 10 s a 96 ° C, 5 s, a 50 ° C e 4 min a 60 ° C
3. A reação Big-Dye é limpo usando um kit comercial (Millipore Montage 96 Seqüenciamento Clean-Up Kit) e processados ​​em um seqüenciador capilar (por exemplo, ABI 3100 DNA).
4. As seqüências são analisadas utilizando o Analisador Biq ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) ou a ferramenta on-line Bisma ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) para derivar o padrão de metilação da região do DNA investigados (Figura 4).

7. Os resultados representativos

Para obter insights sobre a influência de ELS sobre a expressão Avp e status de metilação, os camundongos C57BL/6N foram processados ​​de acordo com o fluxo de trabalho descrito acima. Resumidamente, um grupo de ratinhos foi C57BL/6N subjected a ELS, enquanto o grupo controle foi deixado intacto. O PVN eo núcleo supraóptico (SON) foram perfuradas e DNA e RNA foram isoladas a partir de, simultaneamente, os perfuradores individuais. O ARN foi transcrito inverso e os níveis de transcritos de avp foram medidos por qPCR análise e normalizada para a expressão de genes de limpeza e HPRT GAPDH. O DNA foi tratado com bissulfito, amplificado com os iniciadores específicos para o intensificador de AVP (Figura 4a) e os produtos de PCR foram clonados e sequenciados. Pelo menos 20 clones recombinantes a partir de cada ratinho / PCR foram analisados ​​para determinar as frequências de metilação para os CpGs contidas no fragmento amplificado por PCR (Figura 4b). Comparados aos controles, ELS induziu uma significativa em hipometilação CpG10, CpG12, CpG13 e Cpg14 do enhancer Avp (p <0,05, n = 6-8 animais), sugerindo epigenética marcação desta região reguladora até o início de experiências da vida. Em contraste com o PVN metilação, deo potenciador Avp não foi afectada pelo ELS na especificidade de tecido SON ilustrando de marcação epigenética (Figura 4c). Análise do estado de metilação do DNA em CpG10 e expressão do gene AVP em animais de controlo (n = 6), evidenciaram uma correlação negativa apontando para um papel de metilação de ADN no ajuste fino do AVP a expressão do gene (Figura 4d).

Micropunches Figura 1. São obtidos a partir de cérebros dissecados do controle e do início da vida ratos estressados. Na sequência de DNA e RNA de isolamento, a expressão do gene é determinada por qRT-PCR enquanto DNA bissulfito tratada é amplificado e produtos purificados foram clonados num vector adequado identificação de clones recombinantes, permitindo por azul / branco selecção. Tamanhos de pastilhas corretas são verificados porcolónia PCR antes da realização Big Dye-reacção e processamento em um sequenciador capilar. Padrão de metilação são visualizados por ferramentas de software apropriadas. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. Timeline a partir de DNA / RNA de extracção para sequenciação bissulfito.

Figura 3. De fluxo de trabalho para a extracção simultânea de DNA e RNA. O perfurador do núcleo hipotalâmico paraventricularis, um gene AVP minúscula expressando região do cérebro, é colocado em 400 uL de tampão GTA, vortex até interrompido e ainda homogeneizada por passagem através de uma seringa (29G). O homogenato é então dividido para a purificação de RNA e DNA. A divisão pode ser de 1:1 ou de proporções diferentes, dependendosobre a questão experimental particular. Homogenatos deve ser processado dentro de algumas horas.

Figura 4. Metilação de CpG no locus AVP em 6 de controlo semanas de idade e animais ELS. (A) Esquema da cauda AVP e genes de oxitocina orientada para a cauda e separados pela região intergénica (IGR). Exons são representadas por open (numerada) caixas. A distribuição dos resíduos de CpG é indicado e tamanho e posição do fragmento amplificado por PCR respectivo contendo CpG 10 a CpG14 é marcado por uma linha a negrito. (B) Metilação do potenciador AVP no PVN em animais de controlo e ELS (n = 6-8). (C) Metilação do potenciador Avp no SON no controle e animais Els (n = 8-10). (D) Avp a expressão do gene foi correlacionadacom metilação na CpG10 (n = 6). Clique aqui para ver maior figura .

Discussion

Programação epigenética é cada vez mais reconhecida como um importante mecanismo subjacente de saúde e doença. Aqui apresentamos um método refinado para o isolamento simultâneo de DNA e RNA de micropunches e os passos subsequentes para obter perfis de metilação do DNA através do seqüenciamento bissulfito. O fluxo de trabalho optimizado permite a análise conveniente de programação epigenética no cérebro em resposta a estímulos ambientais. Além disso, esta abordagem facilita a investigação da relação funcional entre a metilação do DNA e expressão do gene que ambos são analisadas a partir da mesma amostra. Finalmente, o número de animais necessários para a experiência pode ser significativamente reduzida.

Certas precauções e orientações devem ser seguidas durante a realização do fluxo de trabalho apresentado. Considerando a complexidade extraordinária e heterogeneidade do cérebro e desde padrão de metilação e expressão pode variar de uma maneira células e tecido específico é de extremamicropunching importância que é realizado de forma padronizada. Como um caso no ponto, a programação epigenética de AVP é detectado no paravaventriuclar, mas não no núcleo supraóptico (Figura 4b-d), duas Avp expressando as regiões do hipotálamo ^4. A este respeito, a disponibilidade de DNA e RNA a partir do soco mesmo tecido é vantajoso como RNA expressão de certos genes marcadores específicos de tecidos podem ser utilizados em alguns casos para certificar que a área correcta foi perfurado. Embora micropunching pode reduzir a heterogeneidade celular, que tem de ser lembrado que esta abordagem não conduz ao isolamento de tipos de células individuais ou populações. Etapas de purificação adicionais poderão ser considerados para abordar o tema.

Para bissulfito de sequenciação desenho de primers de PCR óptima para tratamento com bissulfito de amplificação seguinte é essencial. Os produtos de PCR superiores a 400 pb de comprimento pode ser problemático devido à degradação do ADN pelo btratamento isulfite. Deve também ser notado que a PCR aninhada pode dar resultados enviesados ​​se apenas alguns modelos intactas contribuir para o processo de amplificação. Pares de iniciadores que são específicos para o fragmento amplificado modificado deve ser concebido; suas sequências não deve conter dinucleótidos CpG, a fim de evitar a metilação enviesada amplificação. Além disso, os iniciadores devem conter não CpG citosinas para evitar a amplificação de DNA não modificado ou incompletamente convertido. A amplificação de alguns modelos podem beneficiar de realização de arranque a quente PCR. Em qualquer caso, a adequação de pares de primers deve ser verificado em experiências piloto, de modo a evitar a deterioração de valiosos espécimes experimentais.

Sequenciação de bissulfito representa um método padrão para site-specific análise de metilação como é capaz de forma fiável e precisa detectar a metilação de CpG individuais resíduos de uma forma específica de alelo ^8. O sequenciamento direto do produto da PCR não é aconselhável como misto de metilação ofa resíduo CpG aparecerá como um pico C / T duplo na electroferograma, que pode impedir a quantificação de metilação no local em causa. Por este motivo um passo de clonagem intermediário é conduzido e vários clones são sequenciados (~ 20-30) para determinar a extensão de metilação. Pyrosequencing representa um método alternativo para quantificar a metilação do DNA. Também utiliza conversão bissulfito e bissulfito de PCR mas em vez de clonagem e sequenciação do fragmento amplificado é submetido a uma reacção directa pyrosequencing em que o estado de metilação de um resíduo de CpG é lido como um C / T único polimorfismo de nucleótidos que podem ser facilmente quantificados. Ambos os métodos detectar níveis semelhantes de metilação ^9, mas uma vez que a clonagem passo pode ser omitido pyrosequencing é mais eficiente tempo. No entanto, dependendo do modelo de apenas 40-100 nucleótidos podem ser sequenciados de uma só vez a fim de que vários ciclos de pyrosequencing com iniciador de sequenciação diferente são necessárias. Esta é uma limitação crítica, dado that quantidades mais elevadas de DNA (cerca de 1 mg por reação) são obrigatórios, o que previsível exceder os montantes disponíveis a partir de pequenos socos tecido do cérebro. Assim, a digitalização inicial das regiões na gama de quilobases várias por pyrosequencing aparece menos adequado como leitura único clone. No entanto, após a identificação de uma pequena região de interesse pyrosequencing deve ser considerado.

Coletivamente, o protocolo descrito acima fornece uma abordagem precisa, eficiente e simplificado para a análise rápida e custo-eficaz de micropunches cerebrais para mudanças epigenéticas. Espécimes múltiplas podem ser processadas num único ensaio e os métodos são adequados quando execução amostras de intermediário de tamanho experimentos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Sangue DNeasy & Kit de Tecidos	Qiagen	69506
Nucleospin RNA II	Macherey-Nagel	740.955,50
Epitect Kit Bissulfito	Qiagen	59104
Nucleospin Extract	Macherey-Nagel	740.609,50
pGEM-T vector de clonagem Kit	Promega	A3600
Nucleofast 96	Macherey-Nagel	743.100,50
Montage 96 Seqüenciamento Clean-Up	Millipore	LSK09624
Hotstar Polimerase Taq	Qiagen	203203
Polimerase Taq	Fermentas	EP0401