Vídeo oculografia-in Mice

Resumo

Vídeo oculografia é um método muito quantitativa para investigar o desempenho do motor ocular, bem como a aprendizagem motora. Aqui, nós descrevemos como medir vídeo-oculografia em camundongos. Aplicando esta técnica em normal, farmacologicamente-tratados ou camundongos geneticamente modificados é uma poderosa ferramenta de pesquisa para explorar a fisiologia subjacente de comportamentos motores.

Resumo

Os movimentos oculares são muito importantes, a fim de acompanhar um objeto ou para estabilizar uma imagem na retina durante o movimento. Animais sem uma fóvea, tais como o rato, têm uma capacidade limitada para bloquear os olhos em um alvo. Em contraste com estes movimentos oculares alvo dirigidas, movimentos oculares compensatórios oculares são facilmente atingida em animais afoveate ^1,2,3,4. Movimentos oculares compensatórios são gerados pelo processamento da informação vestibular e optocinético em um sinal de comando que irá conduzir os músculos do olho. O processamento da informação vestibular e optocinético pode ser investigado separadamente e em conjunto, permitindo a especificação de um déficit no sistema oculomotor. O sistema oculomotor pode ser testado por evocar um reflexo optocinético (OKR), reflexo vestíbulo-ocular (RVO) ou um visual aprimorada reflexo vestíbulo-ocular (VVOR). O OKR é um movimento reflexo que compensa "full-campo" movimentos imagem na retina, enquanto que o VOR é uma m olho reflexoovement que compensa movimentos da cabeça. O VVOR é um movimento de olho reflexo que usa tanto o vestibular, bem como informações optocinético para fazer a devida compensação. O cerebelo monitora e é capaz de ajustar estes movimentos oculares de compensação. Portanto, oculografia é uma ferramenta muito poderosa para investigar relação cérebro-comportamento em condições normais, bem como em condições patológicas (fe de ocular, vestibular e / ou origem cerebelar).

Testar o sistema oculomotor, como um paradigma comportamental, é interessante por várias razões. Primeiro, o sistema oculomotor é um sistema bem entendido neural ^5. Segundo, o sistema oculomotor é relativamente simples ^6, a quantidade de movimento dos olhos possível está limitado por sua bola no soquete-arquitetura ("única articulação") e os três pares de músculos extra-oculares ^7. Em terceiro lugar, a saída de comportamento e informação sensorial pode ser facilmente medida, o que torna este um sistema altamente acessível para quantitativoanálise ^8. Muitos testes comportamentais não possuem esse alto nível de poder quantitativo. E, finalmente, tanto o desempenho bem como plasticidade do sistema oculomotor pode ser testada, permitindo que a investigação sobre a aprendizagem e processos de memória ^9.

Camundongos geneticamente modificados são hoje amplamente disponível e formam uma importante fonte para a exploração das funções cerebrais em vários níveis ^10. Além disso, eles podem ser utilizados como modelos para imitar doenças humanas. Aplicando oculografia em normal, farmacologicamente-tratados ou camundongos geneticamente modificados é uma poderosa ferramenta de pesquisa para explorar a fisiologia básica do comportamento motor em condições normais e patológicas. Aqui, nós descrevemos como medir vídeo oculografia em ratos ^8.

Protocolo

1. Preparação

Os seguintes experimentos foram conduzidos de acordo com o Comitê Duch Éticos na Experimentação Animal.

1. Preparando ratos para vídeo oculografia. A fim de medir os movimentos dos olhos de um rato, a cabeça do rato tem de ser imobilizado. Portanto, uma construção do suporte é feita sobre o crânio do rato (Figura 1).
   1. Anestesiar o rato por uma mistura de isoflurano (isofluran% 1-1,5; Rhodia organique Fino Ltd, França) e oxigênio em uma câmara de gás. O excesso de gás é eliminado. Manter a anestesia através do cone do nariz. Confirmar profundidade da anestesia através de uma pitada dedo do pé.
   2. Manter a temperatura do corpo a 37 ° C com a utilização de um sensor térmico anal e uma almofada de aquecimento (FHC, Bowdoinham, ME).
   3. Proteja os olhos, cobrindo-os com uma pomada (duratears, Alcon, Bélgica). Raspar o pêlo dorsal cranial, e limpar a área cirúrgica, com uma rotação de mato e betadine ou solução de clorexidina.
   4. Fazer uma incisão de linha média para expor a superfície dorsal do crânio do crânio. Tornar a superfície limpa e seca.
   5. Aplicar uma gota de ácido fosfórico (ácido fosfórico gel etchant 37,5%; Kerr, CA) na superfície dorsal do crânio do crânio do bregma para lambda. Remover o produto corrosivo após 15 segundos e tornar a superfície do crânio limpar com solução salina e seca novamente.
   6. Aplicar no topo desta superfície atacada craniana uma gota de OptiBond prime (Kerr, CA) e ar seco durante 30 segundos.
   7. Colocar uma gota de adesivo OptiBond (Kerr, CA) na parte superior do primeiro-OptiBond e curar com luz durante 1 minuto (480 Maxima unidade de cura de luz visível; Henry Schein, EUA).
   8. Cobrir a camada adesiva com uma fina camada de compósito Charisma (Heraeus Kulzer, Alemanha). Incorporar duas porcas ligados (diâmetro de 3 mm) no compósito. Curar o depois composto com a luz. Quando necessário, aplique camadas adicionais de composto e curá-los com a luz.
   9. Anúncioministrar buprenorfina (0,015 mg / kg, sc) para analgesia pós-operatória. O animal deve estar de volta em seus pés dentro de cerca de 5 min. Permitir que o rato para recuperar na gaiola de origem à temperatura ambiente durante pelo menos 3 dias após a cirurgia.
2. Vídeo oculografia-setup para camundongos (Figura 2).
   1. Posicione o mouse no limitador e fixar a cabeça para o limitador por dois parafusos (Figura 1). O rato não precisa de ser anestesiado para este procedimento. Tempo de restrição não deve exceder 1 hr / dia.
   2. Montar o rato limitador de cabeça e de corpo-em uma plataforma XY, que por sua vez é montada sobre a mesa giratória (diâmetro: 60 cm). Utilizando a plataforma XY a cabeça de rato pode ser colocado acima do centro do prato giratório. O mouse pode ser movido ao longo dos eixos de guinada, pitch e roll. A cabeça do rato é colocado na correcta passo guinada, e do ângulo de rolo, alinhando o olho usando a imagem visual do olho gerado pelo syste iSCANm. Alternativamente, a construção do suporte pode ser colocado sobre a cabeça do rato em uma moldura estereotáxica ^11.
   3. O prato rotativo está ligado a um motor de CA servocomandadas (harmónica unidade AG, Países Baixos) ea posição da placa giratória é monitorizada por um potenciómetro (Bourns inc., CA) ligado ao eixo giratório.
   4. Uma tela cilíndrica envolvente (diâmetro: 63 cm; altura: 35 cm) com um padrão aleatório pontilhada (cada elemento 2 °) cobre o prato giratório; este tambor está também equipado com um motor de CA servocomandadas (harmónica unidade AG, Países Baixos) . A posição da tela cilíndrica é monitorizada por um potenciómetro (Bourns inc., CA) ligado ao seu eixo e da tela pode ser iluminado por uma luz de halogéneo (20 Watt). Tanto a tela circundante eo prato são accionados independentemente.
   5. O movimento da plataforma giratória e tela circundante é controlado por um computador que está ligado a uma interface I / O (CED limitada, Cambridge, Reino Unido). Tasinais de posição estáveis ​​e em torno de tela são filtrados (corte de frequência: 20 Hz), digitalizados pela interface I / O e armazenados no computador.
   6. O olho do rato é iluminado por três emissores de infravermelho (600 MW, o ângulo de dispersão: 7 °, o pico de comprimento de onda: 880 nm, RS componentes, Países Baixos). Dois emissores de infravermelhos são fixadas à placa giratória eo emissor terceiro está ligado à câmara. Esta terceira emissor produz uma reflexão da córnea de referência (CR), que é utilizado durante o procedimento de calibração e durante as gravações movimento do olho.
   7. Uma câmara CCD infravermelho equipada com uma lente zoom (Zoom 6000, Navitar inc., NY) é ligado ao prato rotativo e é focada sobre a cabeça do rato no centro do prato giratório. A câmera pode ser desbloqueado e pode ser guinar sobre o eixo gira-discos em cima de exatamente 20 ° durante o procedimento de calibração.
   8. O sinal de vídeo é processado por um sistema de seguimento do olho (ETL-200, iSCAN, Burlington, MA). O sistema usa um algoritmo iSCANrithm para rastrear os centros do aluno e do CR de referência. O sistema pode controlar o aluno e referência CR na direção horizontal e vertical, a uma taxa de amostragem de 120 Hz.
   9. Referência de posição CR, a posição da pupila e do tamanho da pupila sinais são digitalizados pelo interface I / O e são armazenadas no mesmo ficheiro como a tabela e sinais de posição em torno da tela. O sistema de vídeo-monitoramento aluno induz a um atraso dos sinais dos movimentos oculares de aproximadamente 27 ms.

2. Calibragem e Medição Movimentos Oculares utilizando vídeo Pupil-tracking

O sistema de seguimento olho capta o movimento da pupila como um movimento de translação. O movimento de translação da pupila rastreadas contém um componente de translação axial devido à diferença entre o centro de rotação do olho e do centro anatómica do olho (ie centro de curvatura da córnea), e um componente rotacional devido à rotação angular do globo ocular. Ao subtrairção o CR de referência a partir do movimento da pupila / posição, o componente indesejado de translação é eliminado a partir do sinal, resultando em um movimento de translação que é apenas devido à rotação do globo ocular. Embora eles são frequentemente muito pequena, o presente subtracção também elimina as traduções entre a cabeça ea câmara. O movimento de translação isolado residual é convertido para a rotação angular do globo ocular pelo método de calibração seguinte ^8,12. Esta calibração foi realizada antes de qualquer experimento movimento dos olhos.

1. Ajustar a posição da cabeça do rato para a câmara de tal modo que a imagem de vídeo da pupila está situado no meio do monitor e que a representação da CR de referência está localizado na linha média vertical do olho de preferência directa acima da pupila. Minimizar os movimentos do CR de referência devido à rotação da câmara angular, que pode ser realizado colocando o centro da curvatura da córnea ao longo do eixo da câmara / tabela.
2. Rodar a câmara várias vezes por + / - 10 ° (isto é 20 graus pico a pico) em torno do eixo vertical da plataforma giratória. Use as posições da pupila de lagartas (P) e do CR de referência registadas nas posições extremas da rotação da câmara para calcular o raio de rotação da pupila (Rp; Rp = Δ / sin (20 °), em que Δ = (CR -P), ver Figura 3A).
3. Devido ao facto de o valor Rp depende do tamanho da pupila, uma correcção do tamanho da pupila necessita de ser implementado ¹² (Figura 3B). Repetir o passo 2.2 muitas vezes sob condições de iluminação diferentes (isto é, a manipulação do tamanho da pupila; Figura 3C), a fim de determinar o tamanho da pupila - relação Rp e compor uma curva de correcção de Rp (Figura 3D). O valor Rp também depende da posição do olho vertical. Quando a experiência fará com que os movimentos oculares verticais, em seguida, uma correção da calibração para as posições oculares verticais é altamente recomendável13.
4. Determinar a posição angular do olho (E) através da medição da referência de posição CR, a posição P e do tamanho da pupila. A posição de referência CR é subtraído a partir da posição da pupila gerando uma posição pupila translacional livre. Ao medir o tamanho da pupila do valor Rp pode ser extraído a partir da curva de correcção Rp e E pode ser calculada usando a seguinte fórmula E = arcsin {(Δ1) / Rp} (Figura 4A; onde Δ1 = (P _{2-P 1)} e P ₁ e P ₂ são corrigidos por subtracção do CR de referência).
5. Um grande repertório de mesa giratória e / ou rotações tela circundantes podem agora ser utilizados para estimular o sistema oculomotor. A fim de executar oculografia vídeo no escuro, o olho do rato tem de ser pré-tratadas com um fármaco miótico para limitar a dilatação da pupila e permitir rastreamento pupila sob estas circunstâncias. Em nossos experimentos, usamos pilocarpina (4%, Laboratórios Chauvin, França) para limitar a dilatação da pupila emno escuro.

3. Análise de Dados

1. Posições do olho, posições da tabela e posições ao redor da tela são todos convertidos em posições angulares (ver Figura 4B e fórmula em 2,4). Sinais oculares são corrigidos para a sua atraso de 27 ms induzida pelo processamento de imagem do sistema pupila-tracking.
2. Posições angulares de tabela olho, ea tela circundante são diferenciados e filtrada com um filtro passa-Butterworth filtro usando um corte de frequência de 20 Hz.
3. Sacadas são removidos do sinal de velocidade olho usando um limiar de detecção de 40 ° s /. Os dados são removidos a partir de 20 ms antes e até 80 ms depois de atravessar o limiar de detecção.
4. Tela da tabela, circundante e sinais de velocidade oculares são calculadas as médias usando cada ciclo individual na pista (Figura 4C).
5. Sinais médios são equipados com uma função apropriada. Em geral, uma estimulação da velocidade sinusoidal é usada ea médiaciclos estão equipados com sinusite ou função cosinus (Figura 4C). Em seguida, o ganho pode ser calculado como a razão entre a velocidade do olho para velocidade do estímulo, enquanto que a fase pode ser calculado como a diferença (em graus) entre a velocidade do olho e velocidade do estímulo.

4. Os resultados representativos

Vídeo oculografia pode ser usado para investigar diversas formas de performances oculomotor (ou seja, reflexo optocinético: OKR; vestibulo-ocular reflex: VOR; visual aprimorada vestibulo-ocular reflex: VVOR), bem como a aprendizagem motora (adaptação VOR; adaptação OKR). O OKR compensa baixa freqüência distúrbios usando feedback visual. O OKR pode ser induzida pela rotação do ecrã bem iluminada circundante (Filme 1). A rotação da tela circundante ao longo de um intervalo de frequência de 0,2 Hz -1,0 com uma amplitude de 1,6 ° mostra como o sistema optocinético é um mecanismo mais eficiente compensatório no intervalo de baixa frequência than na gama de alta frequência (Figura 5A). O VOR compensa movimentos de alta frequência do cabeçote utilizando sinais a partir dos órgãos vestibulares. O VOR pode ser induzida pela rotação do animal (isto é giratória) no escuro (Filme 2). A rotação da placa giratória ao longo de um intervalo de frequência de 0,2 Hz -1,0 com uma amplitude de 1,6 ° demonstra como o sistema vestíbulo-ocular é mais eficiente na geração de movimentos oculares compensadores na gama de alta frequência do que na gama de baixa frequência (Figura 5A) . Quando o ato sistema optocinético e vestíbulo-ocular em conjunto, as imagens podem ser estabilizados na retina através de uma ampla gama de movimentos da cabeça. A rotação da placa giratória ao longo de um intervalo de frequência de 0,2 Hz -1,0 com uma amplitude de 1,6 °, enquanto a tela circundante é bem iluminada (Filme 3) mostra como o olho gera "alto ganho" movimentos compensadores mais de toda a gama de frequências (Figura 5A ). Todos estes ganhos e phase valores são típicos para os ratos, embora as diferenças de gênero ¹⁴ e ^15,16,17 tensão foram relatados.

O controle independente sobre o prato e ao redor da tela permite-nos enfrentar os ratos com um descompasso entre a informação visual e vestibular. Após uma exposição a longo prazo e uniforme de informação visual e vestibular incompatíveis, o VOR do rato mudará para compensar a entrada alteradas visual (adaptação VOR; filme 4). A rotação da placa giratória fora de fase (isto é, 180 °) com a tela circundante (1 Hz, 1,6 °) aumenta o ganho VOR (Figura 5B). A mudança máxima no ganho de VOR, quando se utiliza um um paradigma de aprendizagem, experimentação é frequentemente atingida após 30 minutos.

Figura 1. Desenho esquemático do rato limitador de cabeça e corpo. O corpo do rato é contido utilizandoum tubo de plástico cilíndrico com um diâmetro de 35 mm. A cabeça do rato é imobilizado, ligando o pedestal do mouse para a barra de ferro com dois parafusos. A barra de ferro faz um ângulo de 30 graus, a fim de posicionar a cabeça do rato no tom normal durante a deambulação. *, Vista de topo do pedestal contendo duas porcas.

Figura 2. Desenho esquemático do rato configuração de vídeo oculografia.

Figura 3. A calibração do sistema de vídeo monitoramento de aluno. A) A câmara é rodado várias vezes por + / - 10 ° (isto é 20 graus pico a pico) em torno do eixo vertical da plataforma giratória. A pupila de lagartas (P) e do reflexo de referência da córnea (CR) registadas nas posições extremas da rotação da câmara são utilizados para calcular o raio de rotação da pupila(Rp). B) O raio do diâmetro da pupila é dependente do tamanho da pupila. C) Exemplo mostra o efeito do tamanho da pupila em posição pupila durante o procedimento de calibração (ambos medidos em pixels (px)). D) Relação entre Rp e diâmetro pupilar medido em um único mouse. Os treze diâmetros diferentes pupila foram realizadas através da alteração da intensidade da luz ambiente.

Figura 4. De medição e análise de movimentos dos olhos utilizando vídeo aluno-tracking. A) A posição angular da pupila é calculado a partir do raio da pupila (Rp) ea posição da pupila (P; corrigido para a posição CR). B) Exemplo de movimento ocular compensatório induzido por estimulação do sistema vestibular e visual (visual aprimorada VOR). O disco giratório foi rodado sinusoidalmente, 0,6 Hz, com uma amplitude de 1,6 °, enquanto a tela circundante foi bem iluminada. C) As análises da gravaçãomostrado na B). Gráfico mostra o rastreamento de velocidade média do prato giratório (azul) e aluno (vermelho). Esses traços médios foram equipados com uma função sinusoidal (preto).

Figura 5. Desempenho e aprendizagem do sistema oculomotor medido em um rato C57BL6. Um movimentos oculares) são gerados por rotações em torno da tela (optocinético reflexo: OKR, painéis de topo), girando o mouse no escuro (reflexo vestíbulo-ocular: VOR, painéis de média) e girando o mouse na luz (visualmente reforçada vestíbulo-ocular reflexo: VVOR, painel inferior) com frequências variando de 0,2 a 1,0 Hz a uma amplitude de 1,6 °. O ganho do reflexo foi calculada como a proporção de velocidade olho a velocidade do estímulo (painéis esquerdos) ea fase do reflexo foi calculado a partir da diferença de fase entre a velocidade do olho e velocidade do estímulo (painéis direitos). B) O motor de aprendizagem foi realizada por adaptativamente o aumento da VOR usando um paradigma de formação de fase. O rato foi sujeita a um paradigma de formação visuovestibular em que a rotação do rato foi fora de fase (180 °) com a rotação da tela circundante (tanto rotativo a 1,0 Hz, 1,6 °) durante quarenta minutos. A cada 10 minutos a VOR foi testado (1,0 Hz, 1,6 °). Neste o mouse para fora da fase de treinamento aumentou o ganho de VOR.

Filme 1. Animação que mostra o paradigma que induz OKR em camundongos Clique aqui para ver filme .

Filme 2. Animação que mostra o paradigma que induz VOR em camundongos. Clique aqui para ver filme .

Animation Movie 3. Mostrando o paradigma que induz VVOR em camundongos..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "target =" _blank "> Clique aqui para ver o filme.

4 Movie. Animação que mostra a saída visuovestibular de paradigma fase de treinamento que induz VOR adaptação (aumento) em camundongos. Clique aqui para ver filme .

Discussão

A fim de obter alta qualidade movimentos oculares de vídeo gravações em ratinhos vários requisitos são necessários. O procedimento de calibração precisa de ser realizada na matéria acima mencionado padronizada. Por exemplo fora do centro de calibração, quando a pupila não está posicionado sobre a linha mediana vertical com o CR de referência durante o procedimento de calibração, irá resultar em uma subestimativa de RP e, consequentemente, uma superestimação do movimento do olho. Além disso, recomendamos a integração do aluno método de correção de tamanho no procedimento de calibração ^12, porque os ensaios que mostram o tamanho da pupila muito estável são muito raros. Mesmo estressor uma pequena durante o julgamento já podem alterar substancialmente o diâmetro da pupila.

Ao projetar um experimento movimento dos olhos, os seguintes fatores precisam ser levados em conta ou controladas por eles, porque são conhecidos por afetar a resposta dos movimentos oculares: idade ^13,18, sexo ¹⁴ e cepa ^15,16, 19. Além disso, o animal experimental deve ter íris pigmentadas desde a detecção e seguimento da pupila é impossível quando o contraste entre pupila e da íris é demasiado baixo, como no ratinho BALB / c. Animais extremamente nervosos ou ansiosos precisam ser treinados, antes do experimento, para se acostumar com a montagem experimental e da condição contida. Este animal manipulação procedimento resulta em menos de fecho ou o encerramento do semi-dos olhos e impede a geração de fluidos oculares durante a experiência, e, consequentemente, uma melhor seguimento da pupila é realizado.

Finalmente, a aquisição e análise de dados requer duas a três horas por animal. Portanto, as gravações de movimento dos olhos é provável que permaneçam um procedimento específico aplicado a ratinhos seleccionados e não é adequado como um teste de alta taxa de transferência de triagem.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Isofluran	Rhodia organique Fino LTD
Almofada de aquecimento	FHC	40-90-8
Duratears	Alcon
Gel de ácido fosfórico	Kerr	31297
Optibond principal	Kerr	35369
Optibond adesivo	Kerr	35369
O compósito Charisma	Heraeus Kulzer
Maxima 480 unidade de fotoativação	Henry Schein
AC motor servo-controlado	Harmônica unidade AG
Cyltela Indric
Luz halógena (20 W)	RS componentes
Potentiometers (precisão)	Bourns inc.	6574
Potência 1401 (I / O interface)	CED limitado
Computadores	Dell
Emmitters infravermelho	RS componentes	195-451
ETL-200	ISCAN
Lente zoom (zoom 6000)	Navitar inc.
Pilocarpinenitrate (Mínimos)	Laboratoire Chauvin