Este estudo descreve o desenvolvimento de um In vitro Técnica de electroporação que permite a manipulação da expressão do gene no lábio inferior rômbico de embriões midgestation.
Artigo de método
Este estudo descreve o desenvolvimento de um In vitro Técnica de electroporação que permite a manipulação da expressão do gene no lábio inferior rômbico de embriões midgestation.
O lábio rômbico é um neuroepitélio embrionário localizado no cérebro posterior na junção entre o tubo neural eo roofplate do quarto ventrículo (revisto em 1). O lábio rômbico pode ser subdividido no lábio superior rômbica (URL), que engloba rhombomere 1 (R1) e gera os neurónios do cerebelo eo lábio inferior rômbica (MID), que dá origem a diversas linhagens de tronco cerebral neuronais 2-4. Derivados LRL incluem os neurónios auditivos dos núcleos coclear e aqueles dos núcleos precerebellar que estão envolvidos na regulação do motor e do equilíbrio de controlo 5-8. Neurogênese a partir do LRL ocorre ao longo de uma grande janela temporal que engloba dias embrionários (E) 9,5-16,5 5, 9. Diferentes linhagens neuronais emergir do LRL como células pós-mitóticas (ou nascem) durante diferentes dias de desenvolvimento durante esta janela neurogênica.
Electroporação de construções de expressão de genes pode ser usado paramanipular a expressão do gene em células progenitoras LRL e potencialmente pode mudar o destino dos neurônios produzidos a partir desta região 10-12. Alterando a expressão gênica de células progenitoras LRL no rato através de eletroporação in utero tem sido muito bem sucedida para a manipulação de linhagens nascidos no dia embrionário E12.5 ou mais tarde, 10, 12-14. Em electroporações útero antes E12.5 não tiveram sucesso devido principalmente à letalidade associada a punção da roofplate quarto ventrículo, um passo necessário na entrega de DNA exógeno que é electroporados para o MID. No entanto, muitos LRL linhagens derivadas surgem a partir do LRL mais cedo do que E12.5 9. Estas linhagens anteriormente nascidos incluem os neurónios que compõem a reticular lateral, cuneate externo, e os núcleos olivar inferior do sistema de precerebellar que funcionam de modo a ligar as entradas a partir da medula espinal e do córtex para o cerebelo 5. A fim de manipular expressão na LRLde embriões com menos de E12.5, desenvolvemos um sistema in vitro em que os embriões são colocados em cultura na sequência de electroporação.
Este estudo apresenta um método eficiente e eficaz para manipular a expressão de genes dos progenitores LRL em E11.5. Embriões electroporado com a proteína verde fluorescente (GFP) accionada a partir do promotor CAG amplamente activa reprodutivelmente expressa GFP após 24 horas de cultura. Um aspecto crítico da presente ensaio é que a expressão do gene só podem ser alterados por causa da expressão do gene exógeno e não por causa de efeitos secundários que resultam da electroporação e técnicas de cultura. Foi determinado que os padrões de expressão de genes endógenos permanecer intacta em embriões eletroporados e culta. Este ensaio pode ser utilizado para alterar o destino das células que emergem do LRL de embriões com menos de E12.5 através da introdução de plasmídeos para a superexpressão ou derrubar (através RNAi) de diferentes pró-neurais fatores de transcrição.
1. Preparativos Antes da Eletroporação
2. Colheita embrionário
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A técnica in vitro electroporação apresentado neste estudo é uma nova metodologia que pode ser utilizada de forma eficiente para manipular a expressão do gene em embriões de menos de 12 dias de gestação. Colocação dos embriões em cultura permite a expressão do gene introduzido e contorna a letalidade observada quando embriões eletroporados for permitido permanecer in vivo. Esta técnica permite a manipulação da expressão gênica em células progenitoras embrionárias que anteriormente eram inacess.......
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Não há conflitos de interesse declarados.
Os autores gostariam de agradecer a Jane Johnson para o Math1, Ngn1 e anticorpos Ptf1a e Connie Cepko para o pCAG :: GFP plasmídeo. Este trabalho foi financiado pelo NIH R15 1R15HD059922-01.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Criostato | Leica | CM-1850 | |
| Biologie ponta Dumoxel tratados DUMONT fórceps | Belas Científicos | 11252-30 | |
| 20 milímetros colher perfurada MORIA | Belas Científicos | 10370-17 | |
| ECM 830 Praça Gerador de Eletroporação Onda | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 Tweezertrodes mm * Eletrodos | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp incubadora de CO 2 | Pescador | 1325525 | |
| NAPCO CO Regulador de Gás 2 | Pescador | 15497020 | |
| 12 placas de cultura de tecidos | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone líquido Meios DMEM/F-12 (1:1); com L-glutamina e HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone * Doador soro eqüino | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Soro fetal bovino, Calor, qualificado inativada | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro * 10.000 UI de penicilina, estreptomicina 10.000 g / mL | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone * L-Glutamina L-Glutamina, 200mM em NaCl 0,85% | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Verde | Pescador | AC41053-0250 | 0,01% |
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