Geração de linfócitos T de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células dá uma abordagem alternativa de utilização de células-tronco embrionárias para T imunoterapia baseada em células. O método mostra que, utilizando quer In vitro Ou In vivo Sistema de indução, as células iPS são capazes de se diferenciar em linfócitos T convencionais e antigénio-específica.
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Artigo de método
Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T
Neste artigo
Resumo
Resumo
Transferência adoptiva de células (ACT) de linfócitos-antigénio específico CD8 + T citotóxicos (CTLs) é um promissor no tratamento de uma variedade de doenças malignas 1. CTLs podem reconhecer as células malignas, interagindo antigénios tumorais com os receptores de células T (TCR), e citotoxinas de libertação, bem como as citocinas para matar as células malignas. Sabe-se que menos diferenciadas e central-memória (denominado como altamente reactivo) CTLs são a população óptima para ACT-baseado em imunoterapia, porque estes CTLs têm um elevado potencial proliferativo, são menos propensas a apoptose de células mais diferenciadas e têm uma maior capacidade de responder às citocinas homeostáticos 2-7. No entanto, devido a dificuldades na obtenção de um elevado número de CTLs tais partir de pacientes, há uma necessidade urgente de encontrar uma nova abordagem para gerar altamente reactivos Ag-CTLs específicos para o êxito ACT-terapias baseadas.
TCR transdução do caule auto-renovávelAs células para a reconstituição imunológica tem um potencial terapêutico para o tratamento de doenças 8-10. No entanto, a abordagem para obter células-tronco embrionárias (CES) de pacientes não é viável. Embora a utilização de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) para fins terapêuticos tem sido amplamente aplicada na clínica 11-13, HSCs ter reduzido a diferenciação e capacidades proliferativas, e HSCs são difíceis de expandir-se em cultura de células in vitro 14-16. Tecnologia de célula iPS recente eo desenvolvimento de um sistema in vitro para a entrega do gene são capazes de gerar células iPS de pacientes sem qualquer abordagem cirúrgica. Além disso, como os CES, as células iPS possuem capacidade proliferativa indefinido in vitro, e têm sido mostrados para se diferenciarem em células hematopoiéticas. Assim, as células iPS têm um maior potencial para ser usado em ACT-baseado em imunoterapia em comparação com os CES ou HSCs.
Aqui, nós apresentamos métodos para a geração de linfócito Tcitos de iPS células in vitro, e em programação in vivo de antigénios específicos de CTLs de iPS células para promover a vigilância do cancro imune. Estimulação in vitro com um ligando Notch impulsiona a diferenciação das células T a partir de células iPS, e os resultados de genes de TCR de transdução em células iPS diferenciar em específicas de antigénio de células T in vivo, o que impede o crescimento do tumor. Assim, demonstramos antigénio-específica diferenciação de células T a partir de células iPS. Os nossos estudos proporcionam uma abordagem potencialmente mais eficiente para a geração de antigénio-CTLs específicos para o ACT terapias baseadas e facilitar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças.
Protocolo
1. Cultura de Células
- Preparação das células de alimentação irradiadas SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) para a cultura.
SNL76 / 7 células são geralmente mantidas em 10% de soro fetal bovino (FBS) Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) meios de comunicação.- Um prato de cultura ou frasco vai ser revestida com 0,1% de solução de gelatina em 37 ° C; incubadora durante 30 minutos, antes de recuperar SNL76 / 7 células a partir de azoto líquido.
- Quando SNL76 / 7 células atingem a confluência, as células serão tripsinizadas fora, centrifugado a 400 g durante 5 min e ressuspensas em meio fresco.
- Ressuspensas SNL76 / 7 células serão irradiad....
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Discussão
Para ACT-terapias baseadas, o em geração in vitro de um grande número de altamente reactivos Ag-específicos de células T in vivo para re-infusão é uma abordagem ideal. Embora o nosso método in vitro dá origem de células T funcionais a partir de células iPS, um grande número de iPS células derivadas de células morrem em quatro semanas, especialmente na quarta semana. Concluímos que os sinais de sobrevivência a partir do entalhe de sinalização mediada pelo DL1, bem como a IL-7 e F.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Shinya Yamanaka (Universidade de Kyoto) para a prestação de iPS-MEF-Ng-20D-17 linha celular, Dr. Dario Vignali (Hospital St. Jude Children Research) para apoiar a OT1-2A • pMig II construção, Dr. Juan Carlos Zuniga-Pflucker (Departamento de Imunologia da Universidade de Toronto) para apoiar a linha celular OP9-DL1, e Dr. Kent E Vrana (Departamento de Farmacologia, da Universidade Penn State College of Medicine) para ajudar o projeto deste estudo. Este projecto é financiado, em bolsas com o número de Grant K18CA151798 do Instituto Nacional do Câncer, o Trust Barsumian eo Melanoma Research Foundation (Song J.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Camundongos C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S7-RAG1 tm1Mom / J | Jackson Laboratory | 002216 | |
| Anticorpo anti-CD3 (2C11) | BD PharMingen | 553058 | |
| Anti-CD28 anticorpo (37,51) | BD PharMingen | 553295 | |
| Anticorpo anti-CD3 (17A2) | BioLegend | 100202 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) anticorpo | BioLegend | 100417 | |
| Anti-CD8 (53-6,7) anticorpo | BioLegend | 100714 | |
| Anti-CD25 anticorpo (3C7) | BioLegend | 101912 | |
| Umti-CD44 anticorpo (1M7) | BioLegend | 103012 | |
| Anti-CD117 anticorpo (2B8) | BioLegend | 105812 | |
| Anti-TCR β-(H57597) anticorpo | BioLegend | 109220 | |
| Anti-IL-2 (JES6-5H4) anticorpo | BioLegend | 503810 | |
| Anti-IFN-γ anticorpo (XMG1.2) | BioLegend | 505822 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| FBS | HyClone | SH3007.01 | |
| A Brefeldin | Sigma | B7651 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| GeneJammer | Ciências Integradas | 204130 | |
| RNA kit | Qiagen | 74104 | |
| DNA kit | Qiagen | 69504 | |
| CD8 estojo de isolamento | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| Tampão de lise ACK | Lonza | 10-548E | |
| mFlt-3L | PeproTech | 250-31L | |
| mIL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| Gelatina | Sigma | G9391 | |
| FITC-anti-OVA anticorpo | Immunochemicals Rockland | 200-4233 | |
| Tampão de permeabilização | Biolegend | 421002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Formaldeído | Sigma | F8775 | |
| 0,4 mM de filtro | Millipore | ||
| Sorter celular Moflo | Cytomation Dake | ||
| Calibur citômetro de fluxo | BD | ||
| LSR citômetro de fluxo II | BD | ||
| Rato limitador | Braintree Científico |
Referências
- Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Se....
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Reimpressões e permissões
