Summary
एक ऑप्टिकल प्रणाली FITC लेबल एरिथ्रोसाइट्स के साथ यकृत microcirculation और कल्पना, microvessels में लेजर सहायता phosphorimetry के साथ ऑक्सीजन की आंशिक दबाव मापने के लिए विकसित किया गया था. इस विधि के microvascular संरचना, व्यास, रक्त प्रवाह वेग, और ऑक्सीजन तनाव का विश्लेषण करके शारीरिक और रोग तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
जिगर में ऑक्सीजन की आपूर्ति और मांग के बीच एक काफी विसंगति है क्योंकि यकृत ऑक्सीजन की खपत अपेक्षाकृत उच्च है, लेकिन यकृत रक्त की आपूर्ति के बारे में 70% खराब पोर्टल शिरा जठरांत्र संबंधी मार्ग और तिल्ली से प्राप्त रक्त से oxygenated है. ऑक्सीजन रक्त पोर्टल शिरा के एक टर्मिनल शाखा से sinusoids के माध्यम से केंद्रीय venule बह द्वारा से hepatocytes करने के लिए दिया जाता है, और यह यकृत lobules में ऑक्सीजन ढाल बनाता है. ऑक्सीजन ढाल एक महत्वपूर्ण शारीरिक पैरामीटर है कि नदी के ऊपर और नीचे की ओर यकृत microcirculation में एंजाइमों की अभिव्यक्ति है, लेकिन यकृत microcirculation में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए तकनीक की कमी के कारण जिगर में ऑक्सीजन चयापचय से संबंधित तंत्र की व्याख्या में देरी शामिल है. इसलिए हम FITC लेबल एरिथ्रोसाइट्स इस्तेमाल यकृत microcirculation कल्पना करने के लिए और लेजर सहायता phosphorimetry के इस्तेमाल किया microvessels में ऑक्सीजन की आंशिक दबाव को मापने. Noncontaसीटी और निरंतर ऑप्टिकल माप रक्त प्रवाह वेग, पोत व्यास, और ऑक्सीजन gradients के जिगर में ऑक्सीजन की खपत से संबंधित यों कर सकते हैं. एक तीव्र हैपेटाइटिस मॉडल में हम चूहों हम दोनों पोर्टल और केंद्रीय venules में वृद्धि हुई ऑक्सीजन का दबाव है लेकिन एक कम sinusoids में ऑक्सीजन ढाल मनाया एसिटामिनोफेन प्रशासन द्वारा किए गए, यह दर्शाता है कि hepatocyte परिगलन pericentral क्षेत्र में ऑक्सीजन दबाव बदलाव ऊपर और एंजाइम अभिव्यक्ति प्रभावित periportal क्षेत्र में. अंत में, हमारे यकृत hemodynamics और ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए ऑप्टिकल तरीकों यकृत रोग से संबंधित तंत्र प्रकट कर सकते हैं.
Protocol
1. Fluorescein आइसोथियोसाइनेट isomer मैं (FITC) के साथ लेबल एरिथ्रोसाइट्स
सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल हम इस्तेमाल Keio विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन के पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
- एक दाता चूहों चतनाशून्य करना, और बनाने के बाद एक celiotomy चीरा अवर रग Cava से एक 1 मिलीलीटर हेपरिन की छोटी राशि वाले सिरिंज के साथ पूरे रक्त वापस ले. माउस तुरंत सोडियम pentobarbital इंजेक्शन (100 आईपी मिलीग्राम / किग्रा) द्वारा euthanized किया गया था.
- पूरे रक्त पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ दो बार रोटर झूलते - बाल्टी में 400 जी में 5 मिनट के लिए धो centrifugation द्वारा.
- FITC के 100 मिमी ना 2 4 HPO 5 मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम भंग और यह 0.22 - माइक्रोन pores होने झिल्ली के साथ फ़िल्टर.
- एक टेस्ट ट्यूब में 3 मिमी ग्लूकोज के 0.15 मिलीग्राम, 180 मिमी नः 2 100 मिमी 4 पीओ, और 1.5 मिलीग्राम ना 2 4 HPO से 0.25 मिलीग्राम के साथ FITC समाधान के 1 मिलीग्राम मिश्रण. आर के 0.2 मिलीलीटर जोड़ेंई.पू., गोली और मिश्रण के लिए ट्यूब नल.
- ट्यूब डिग्री सेल्सियस 4 में 2 घंटे के लिए रखें और फिर पीबीएस में दाग लाल रक्त कोशिकाओं को दो बार धोना.
- एक स्लाइड घास के पर आरबीसी निलंबन की एक छोटी राशि डाल और यदि लाल रक्त कोशिकाओं को स्वस्थ देखो देखने के लिए (यानी, कि उनके आकार और आकार सामान्य हो रहे हैं) और प्रतिदीप्ति तीव्रता पर्याप्त है कि.
- 7.4 पीएच में पीबीएस की 0.9 मिलीलीटर में लाल रक्त कोशिकाओं की 0.1 मिलीलीटर स्थगित और 4 पर निलंबन रखने ° C इंजेक्शन तक.
2. ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील डाई की तैयारी
- BSA के 500 मिलीग्राम 7.4 पीएच में पीबीएस की 10 मिलीलीटर में भंग.
- पीडी के 30 मिलीग्राम (द्वितीय) meso टेट्रा (4 carboxyphenyl) बीएसए समाधान (पी.डी. - TCPP) porphine और रातोंरात हलचल.
- (वैकल्पिक) गुरुत्वाकर्षण प्रवाह क्रोमैटोग्राफी या एक स्पिन स्तंभ का उपयोग करने के लिए यह पीडी - TCPP मुफ्त से अलग पी.डी. - TCPP बीएसए बाध्य निकालें.
- अघुलित पी.डी. - TCPP निकालने के लिए, और एक झिल्ली फिल्टर 0.22 - माइक्रोन pores होने के साथ सतह पर तैरनेवाला फिल्टर समाधान अपकेंद्रित्र. </ Li>
- स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर ट्यूबों में aliquots दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र से बचें.
3. पशु तैयारी
- Microcirculation का सूक्ष्म अवलोकन के लिए 20 मिमी व्यास में एक छेद है, और टेप छेद पर एक 30 मिमी वर्ग वर्ग कवर गिलास के साथ एक प्लास्टिक की थाली तैयार है.
- माउस चतनाशून्य करना, फर निकालने के लिए, और प्रस्तुत करने का त्वचा. दवा के इंजेक्शन के लिए व्यर्थ पूंछ में एक 30 जी एक 10 सेमी (10 पीई) heparinized पीबीएस से भरा पॉलीथीन कैथेटर से जुड़ा सुई का उपयोग करके एक कैथेटर रखें.
- मंझला चीरा के बाद, प्लास्टिक प्लेट पर जिगर की मुख्य छोटि लो विस्तार, और sternal अवलंबन में माउस जगह.
- रसोईघर (3 मिमी x 8 मिमी) और यकृत श्वसन साथ जिगर की चलती है और यह सुखाने से रखने रोकना पालि के किनारे के आसपास उन्हें टाइल की चादर के साथ छोटे निकल जाता है तैयार.
- एक खुर्दबीन के नीचे यकृत microcirculation (पारेषित प्रकाश के साथ) को देखें, और पुष्टि करते हैं कि खlood प्रवाह कम से कम 15 मिनट के लिए देखने के क्षेत्र में कोई ठहराव है.
- धीरे धीरे रक्त प्रवाह अवलोकन या समाधान PD-TCPP के PO 2 माप के लिए 0.2 मिलीलीटर के लिए fluorescently लेबल लाल रक्त कोशिकाओं की 0.2 मिलीलीटर इंजेक्षन. FITC लेबल लाल रक्त कोशिकाओं की यह राशि 1/50 के लिए कल्पना क्षेत्र में संचलन में लाल रक्त कोशिकाओं के खाते में जाएगा.
4. रक्त प्रवाह विज़ुअलाइज़ेशन
- यह पारा दीपक प्रकाश कि एक bandpass फिल्टर (450-490 एनएम) 1 के माध्यम से पारित कर दिया गया है के साथ irradiating द्वारा FITC उत्तेजित.
- एक सीसीडी कैमरे के साथ फ्लोरोसेंट छवि रिकार्ड.
5. PO 2 मापन
पी.डी. TCPP स्फुरदीप्ति अपेक्षाकृत कमजोर है और एक उच्च संवेदनशीलता डिटेक्टर के साथ पता लगाया जाना चाहिए. सभी प्रयोगों के लिए एक अंधेरे कमरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
- अवशोषण PD-TCPP के चोटियों 410 एनएम और 532 एनएम पर हैं, तो दूसरी हार्मोनिक तरंग दैर्ध्य 532 एनएम उत्तेजना के लिए सिफारिश की है. YAG नाड़ी लेजर 2: यह तरंग दैर्ध्य के एक एन डी द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है.
- उलटा माइक्रोस्कोप पर उचित बंदरगाह में YAG लेजर, और फोकल हवाई जहाज़ में एक केंद्रीय स्थान बीम स्थान समायोजित फ़ीड: एन डी से बीम. स्थानिक संकल्प लेजर स्थान आकार है, जो एक pinhole के माध्यम से बीम गुजर से बदल रहा है पर निर्भर करता है.
- स्फुरदीप्ति का पता लगाने के लिए, एक लंबे समय से गुजारें फिल्टर (> 620 एनएम) और खुर्दबीन के अन्य बंदरगाह के लिए एक photomultiplier ट्यूब (पी एम टी) देते हैं. पी एम टी 700 एनएम के आसपास विशेष रूप से, लाल तरंग दैर्ध्य के प्रति संवेदनशील होना चाहिए.
- स्फुरदीप्ति संकेत (500 अंक 200 kHz पर नमूना) नमूना और क्षय के लिए एक घातीय समारोह फिटिंग द्वारा क्षय की लगातार समय की गणना.
- अंशांकन के लिए PO 2 150 mmHg और 0 mmHg के साथ PD-TCPP समाधान के नमूनों की दो सेट तैयार करते हैं. Dithionite सोडियम की मात्रा में 1% करने के लिए ऑक्सीजन के अभाव उत्पादन नमूना. 7.4 नमूने के pH और तापमान रखें37 ° C पर अंशांकन के दौरान ऊपरी.
- स्टर्न Volmer कश्मीर क्ष निरंतर और ऑक्सीजन मुक्त luminescence क्षय समय τ समीकरण में 0 (1) 3 फिक्स. पी.डी. - TCPP 37 डिग्री सेल्सियस और 7.4 का एक pH समाधान के साथ हमारे मामले में, कश्मीर क्ष 374 mmHg -1 एस -1 है और τ 0 0.74 एमएस है. इन माप मानकों उपकरण (यानी लेजर डिटेक्टर, अन्य ऑप्टिकल उपकरणों) और सिग्नल प्रोसेसिंग विधि पर निर्भर करती है, ताकि यह अंशांकन प्रत्येक माप 4 प्रणाली में की जरूरत है.
τ 0 / τ = 1 + कश्मीर क्ष • 0 τ • 2 PO (1) - खुर्दबीन मंच पर थाली पर माउस सेट, यकृत microcirculation निरीक्षण, और लेजर स्थान की बात के लक्ष्य microvessel की स्थिति को समायोजित.
6. हेपेटाइटिस मॉडल
- रात भर पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ तेजी से चूहों.
- एक तैयारDMSO में एसिटामिनोफेन (Apap) की मिलीलीटर समाधान प्रति 20 मिलीग्राम.
- यह intraperitonealy इंजेक्षन में 1 ml/100 जी bw (यानी, 200 मिलीग्राम / किलो bw). इंजेक्शन के बाद, माउस भोजन और जल 5 के लिए स्वतंत्र पहुँच दी जा सकती है.
- इंजेक्शन के बाद 24 घंटे, माउस चतनाशून्य करना और एक मंझला चीरा द्वारा जिगर बेनकाब. यदि हेपेटाइटिस हासिल है pericentral क्षेत्र में परिगलन आसानी से नग्न आंखों को दिखाई हो जाएगा.
7. प्रतिनिधि परिणाम
यकृत microcirculation का उदाहरण छवियों चित्रा 1, जहां (क) एक छवि संचारित प्रकाश और (ख) एक प्रतिदीप्ति छवि में दिखाया जाता है. व्यक्तिगत FITC लेबल एरिथ्रोसाइट्स वीडियो फिल्म में मनाया जाता है, और पोर्टल venules, sinusoids, और केंद्रीय venules रक्त प्रवाह दिशाओं द्वारा मान्यता प्राप्त हैं.
चित्रा 2 में दिखाया गया है, लेजर स्थान से X100 उद्देश्य लेंस के माध्यम से केंद्रीय venule irradiating approximately व्यास में 10 माइक्रोन. Intravascular यकृत microcirculation में 2 PO पुरुष C57BL / 6 चूहों में मापा गया था, और चित्रा 3 (एक) 2 पीओ और पोर्टल और केंद्रीय venules में पोत व्यास के बीच संबंधों का पता चलता है. केंद्रीय venules के पोर्टल से PO 2 ढाल है कि लाल रक्त कोशिकाओं रिहाई ऑक्सीजन कुशलता से इंगित करता है जबकि sinusoids के माध्यम से गुजर. के रूप में चित्रा 3 (ख) में दिखाया गया है, औसत 2 PO पोर्टल वाहिकाओं, sinusoids में 48.2 mmHg और केंद्रीय venules में 38.9 mmHg में 59.8 mmHg था.
जब हम Apap intraperitonealy इंजेक्शन द्वारा उत्पादित तीव्र हैपेटाइटिस, intravascular PO 2 काफी यकृत microcirculation का प्रत्येक भाग में ऊपर उठाया गया था: पी <0.05 पोर्टल और नसों में sinusoids और केंद्रीय नसों (चित्रा 3 (ग)) <पी .01.
मैं चित्र 1 कम बढ़ाई.mages (क) पारेषित प्रकाश और (ख) प्रतिदीप्ति के साथ यकृत microcirculation दिखा.
चित्रा 2 लेजर PO 2 माप के लिए एक लक्षित केंद्रीय venule के irradiating स्थान की छवि.
चित्रा स्वस्थ नियंत्रण चूहों के और acetaminophen प्रेरित यकृत की चोट के साथ चूहों के यकृत microcirculation में 3. PO 2 ढाल. (एक) 2 PO बनाम पोर्टल (पीवी) venules और केंद्रीय venules (सीवी) के लिए पोत व्यास से पता चलता है, और (ख) sinusoids (एस) के माध्यम से ऑक्सीजन पी.वी. से CV के लिए ढाल से पता चलता है. PV और CV के बीच PO 2 अंतर hepatocytes या अन्य parenchymal कोशिकाओं की ऑक्सीजन की खपत को दर्शाता है. (ग) से पता चलता है कि हेपेटाइटिस Apap प्रशासन द्वारा प्रेरित स्थितियों में, PO 2 काफी पी.वी., एस, और CV और 2 PO में ऊपर उठाया गया थाढाल की कमी हुई, यह दर्शाता है कि यकृत ऑक्सीजन की खपत समझौता किया था.
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Discussion
ऊतकों को ऑक्सीजन पहुंचाने के microcirculation का एक अनिवार्य भूमिका है, और पत्र की एक बहुत microvessel शरीर रचना और rheology 6 संबंधित रोगों का वर्णन है. जिगर रक्त प्रवाह धमनी और शिरापरक रक्त का एक संयोजन है. खून जिगर के प्रवाह के बारे में 30% अच्छी तरह से oxygenated रक्त यकृत धमनी और अन्य 70%, पोर्टल शिरा द्वारा प्रदान द्वारा प्रदान की है, प्लीहा और जठरांत्र संबंधी मार्ग सात से खराब से oxygenated रक्त शिरापरक बहिर्वाह है. यकृत रोग फैटी लीवर, सदमा, या ट्यूमर परिवर्तन यकृत microcirculation में रक्त के प्रवाह के रूप में. ऊतक oxygenation को निर्धारित करने के लिए, दोनों रक्त प्रवाह और microcirculation में ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने की जरूरत है. यकृत microcirculation में इन मापन बनाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों की कमी के कारण यह इस क्षेत्र में शारीरिक डेटा प्राप्त करने के लिए कठिन बना दिया है.
पशु तैयारी चरणों में एक महत्वपूर्ण बिंदु का निर्धारणएक प्लास्टिक की प्लेट पर जिगर. जिगर आंदोलन में ढीला निर्धारण परिणाम श्वसन, जो सूक्ष्म अवलोकन के साथ हस्तक्षेप है और विश्लेषण कठिन बनाता है के साथ सिंक्रनाइज़. तंग निर्धारण, तथापि, रक्त प्रवाह ठहराव का कारण बनता है. रक्त प्रवाह की स्थिति ऑपरेटिव प्रक्रिया के दौरान एक कम शक्ति माइक्रोस्कोप हालांकि मनाया जाना चाहिए. उच्च शक्ति लेज़रों आसानी से घायल microvessels, तो विकिरण की आवृत्ति कम से कम किया जाना चाहिए. 1 हर्ट्ज आमतौर पर अस्थायी 8 माप के लिए पर्याप्त है. हालांकि, 2 पुलिस के एक माप कम से कम 1 एमएस, जिसका अर्थ है कि पुनरावृत्ति आवृत्ति तेजी PO 2 परिवर्तन के लिए 1 kHz करने के लिए वृद्धि हुई किया जा सकता है आवश्यक के रूप में लेता है. इसके अलावा, PD-TCPP की रासायनिक प्रतिक्रिया स्वेटर ऑक्सीजन है कि नुकसान microvessels उत्पन्न करता है और प्लेटलेट एकत्रीकरण लाती है 9. प्रतिदीप्ति इमेजिंग और पुलिस दो माप के संयोजन के रक्त प्रवाह की गतिशीलता और ऑक्सीजन एकाग्रता सब एक साथ उपाय कर सकते हैं. बुध दीपक विकिरणरोमांचक FITC भी पी.डी. - TCPP उत्तेजित है, तथापि, जिससे ज्यादा स्वेटर ऑक्सीजन और रक्त प्रवाह ठहराव के लिए अग्रणी. जब दोनों के रक्त प्रवाह और ऑक्सीजन तनाव एक ही पशुओं में मापा जाता है, FITC इमेजिंग से पहले का पी.डी. - TCPP प्रशासित किया जाता है किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, प्रणालीगत ऑक्सीजन का स्तर ऊतकों में ऑक्सीजन की खपत का संकेत है. यह प्रयोगों के दौरान सांस प्रबंधन करने के लिए बेहतर है या प्रयोगों के बाद रक्त गैस के स्तर का विश्लेषण.
हम Apap का इस्तेमाल किया तीव्र हैपेटाइटिस प्रेरित करने के लिए, भाग में, क्योंकि Apap के एक उच्च खुराक सेल परिगलन pericentral 10 क्षेत्र में नेतृत्व करने के लिए जाना जाता है. आंशिक ऑक्सीजन दबाव माप से पता चला है पोर्टल और नियंत्रण चूहों में venules केंद्रीय venules के बीच 20.9 mmHg PO 2 अंतर Apap का इलाज चूहों में 16.9 mmHg की कमी हुई और है कि 2 PO यकृत microcirculation भर में अधिक था. यकृत microcirculation में ऑक्सीजन ढाल मुख्य रूप से ऑक्सीजन suppl का परिणाम हैपोर्टल hepatocytes में खपत venules से आइईडी. Apap की उच्च खुराक pericentral क्षेत्र 11, 12 में परिगलन लाती है, और जो ऑक्सीजन की खपत के बहाव में कमी के रूप में चित्र 3c में दिखाया जा सका. विस्तृत जिगर हैपेटाइटिस, विशेष रूप से ऊतक परिगलन और ऑक्सीजन के स्तर के बीच संबंध, परिगलन की हद तक की मात्रा का ठहराव, और बिलीरूबिन, ALT, AST, और भड़काऊ साइटोकिन्स के सीरम स्तर अंतर्निहित तंत्र को निर्धारित करने के लिए मापा जाना चाहिए. यकृत रोगों के एक बहुत यकृत microcirculation से संबंधित है, दूसरे शब्दों में रक्त के प्रवाह वितरण, ऑक्सीजन वितरण, और यकृत के ऊतकों में ऑक्सीजन की खपत,. पुरानी शराब सेवन के मामलों में, शराब के बारे में 10-15% माइक्रोसोमल इथेनॉल ऑक्सीकरण प्रणाली द्वारा metabolized है, और अणु शराब प्रेरित P450IIE1 के 13 NAPQI, विषाक्त metabolite है कि pericentral hepatocyte परिगलन 14 की ओर जाता है उत्पन्न.
अंत में, हमारे ऑप्टिकल विदेश मंत्रालय केsurement विधि के microvascular संरचना, व्यास, रक्त प्रवाह वेग, और ऑक्सीजन तनाव का विश्लेषण करके शारीरिक और रोग तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखक तकनीकी सहायता और मदद प्रयोगों के लिए सुश्री Risa ओत्सुका धन्यवाद. इस शोध आंशिक रूप से शिक्षा मंत्रालय, विज्ञान, खेल और संस्कृति के द्वारा समर्थित किया गया अनुदान सहायता में युवा वैज्ञानिकों (बी), 2010, 22,700,476, और के.टी. के लिए Suzuken मेमोरियल 2010 फाउंडेशन और इस अध्ययन के अनुसंधान और विकास द्वारा समर्थित किया गया के लिए रहते हैं बात है, और अगली पीढ़ी MEXT की सुपर परियोजना के विकास में इस्तेमाल की एक भाग, JST ERATO Suematsu गैस जीवविज्ञान परियोजना से भाग में और अगली पीढ़ी के एकीकृत सिमुलेशन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
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