Artigo de método

O α-teste: Rapid livre de células CD4 enumeração Utilizando saliva total

12.9K vistas

⸱

DOI:

10.3791/3999

⸱

16 de maio de 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College , 2Department of Oral Biology, University of Missouri-Kansas City-School of Dentistry, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Missouri Kansas City- School of Pharmacy, 4Regional Hospital, Bamenda, NWP, Cameroon, 5Mezam Polyclinic HIV/AIDS Treatment Center, Cameroon, 6Institute for Human Genetics and Biochemistry

Neste artigo

Resumo

Um método de enumeração de células CD4, o α-teste, é descrito que utiliza saliva total para fornecer contagens de CD4 rápidos e precisos. As α-teste tostões custos e elimina a necessidade de formação técnica, reagentes caros, tais como anticorpos monoclonais, instrumentação, refrigeração, transporte de amostras, bem como coleta e manuseio de sangue.

Resumo

Há uma necessidade urgente de enumeração CD4 acessível para monitorar a doença HIV. Enumeração de CD4 está fora de alcance em regiões com recursos limitados, devido ao tempo e as restrições de temperatura, a sofisticação técnica e custo dos reagentes, em particular anticorpos monoclonais para medir o CD4 nas células sanguíneas, o único método atualmente aceitável. Uma estratégia comumente utilizada laboratório de economia de custos e economia de tempo é de calcular, em vez de valores de medidas determinadas no sangue. Por exemplo, os níveis de LDL são calculados usando os níveis medidos de colesterol total, HDL e triglicéridos 1. Assim, a identificação de células livres que se correlaciona directamente regulam o número de células T CD4 + poderiam fornecer um método preciso para calcular contagem de células CD4, devido à relevância fisiológica dos correlatos.

O número de células estaminais que entram no sangue e destinam-se a tornar-se circular células T CD4 + é determinado pelo quimiocina CXCL12 umnd seu receptor CXCR4 devido à sua influência sobre a locomoção 2. O processo de locomoção de células estaminais no sangue é adicionalmente regulada por superfície celular leucocitário humano elastase (HLE CS) e da HLE CS-reactivo activo α 1 inibidor de protease (α 1 PI, α 1 antitripsina, SERPINA1) 3. Em HIV-1 da doença, α 1 PI é inactivado devido a processos de doença 4. Nas categorias iniciais assintomáticos de HIV-1 da doença, activa α 1 PI foi encontrado para ser abaixo do normal em 100% de HIV-1 não tratados (doentes mediana = 12 uM, e para conseguir os níveis normais durante as categorias sintomáticos 4, 5. Este padrão tem sido atribuído à inactivação imunitário, não para a síntese insuficiente, a inactivação proteolítica, ou oxigenação. Observou-se que em HIV-1 indivíduos com> 220 CD4 células / uL, as contagens de CD4 foram correlacionados com os níveis séricos de activa α 1 PI (r 2 = 0,93, p < 0,0001, n = 26) e inativos α 1 PI (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 26) 5. A administração de α 1 PI ao HIV-1 indivíduos infectados e não infectados resultou em aumentos dramáticos na contagem de CD4, sugerindo α 1 PI participa na regulação do número de células T CD4 + no sangue 3.

Com a estimulação, a saliva contém todo exsudato seroso suficiente (plasma contendo material proteináceo que passa através das paredes dos vasos sanguíneos na saliva) para permitir a medição de ativos α 1 PI ea correlação dessa medida é prova de que é um método preciso para calcular os valores de CD4. Resumidamente, sialogogues tais como goma de mascar ou ácido cítrico estimular a exsudação de soro na saliva boca inteira. Depois de estimular a exsudação de soro, a actividade de soro α 1 PI na saliva é medido pela sua capacidade para inibir a actividade da elastase. Pâncreas suíno elastase (PPE)é uma fonte facilmente disponível barato de elastase. PPE liga-se a α 1 PI formação de um complexo um-para-um que impede PPE de clivar os seus substratos específicos, um dos quais é o péptido colorimétricas, succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). A incubação de saliva com uma concentração saturante de EPI durante 10 min à temperatura ambiente permite a ligação de PPE para todas activas α a 1 PI na saliva. A inibição resultante de EPI por activo α 1 PI pode ser medido através da adição do substrato PPE SA 3 NA. (Figura 1). Embora as contagens de CD4 são medidos em termos de volume de sangue (CD4 células / mL), a concentração de α PI 1 na saliva está relacionado com a concentração de soro na saliva, não a um volume de saliva desde que o volume pode variar consideravelmente durante o dia, por pessoa para pessoa 6. No entanto, virtualmente toda a proteína na saliva é devido ao teor de soro, eo teor de proteína de saliva é MEAmensuráveis ​​7. Assim, activa α 1 PI na saliva é calculada como uma razão para o conteúdo de proteína saliva e é denominado o α 1 Índice PI. Os resultados apresentados aqui demonstram que o Índice de α 1 PI fornece um método exacta e precisa fisiológica para calcular os valores de CD4.

Protocolo

1. Prepare frescos Soluções de Trabalho

  1. TBS: 0,05 M de Tris pH tamponada, solução salina 7,8 (TBS). Preparar 60 ml de TBS / microplaca.
  2. PPE: elastase pancreática porcina, tipo 1 (PPE) é fornecida como uma suspensão. Agitar bem e diluir PPE em TBS a cerca de 0,01 U / ml. Preparar 6 ml de solução de trabalho / microplaca).
  3. SA 3 NA: succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). Preparar 0,1 M estoque SA 3 solução de NA em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e usar imediatamente ou armazenar a -20 ° C. Preparar solução de trabalho 6ml / microplaca, diluindo estoque SA 3 solução de NA 1/100 em TBS.
  4. Azul de Coomassie: Preparar uma solução-mãe de 10% de Coomassie Brilliant Blue R-250 (Azul de Coomassie) em TBS e usar imediatamente ou armazenar a -20 ° C. Preparar 6 ml de solução de trabalho por diluição de solução stock 1/1000 em TBS.

2. Prepare Saliva

  1. RECOLHA saliva: Na posição de pé, estimulam a exsudação soro em saliva colocando um sialogogo tal como ácido cítrico ou de goma de mascar na boca. Uma gota de limão sem açúcar é conveniente para os pacientes HIV-1 que são freqüentemente desdentada e incapaz de mascar chiclete. Engula como necessária para a 3 minutos em primeiro lugar, e coletar saliva boca inteira em um copo com tampa para a próxima 3 min. Isto irá fornecer cerca de 2 ml de saliva. Use imediatamente ou armazenar a -80 ° C.
  2. MANUSEAMENTO saliva: Se a amostra descongelamento congelado, a 37 ° C e colocar em gelo. Armazenar amostra fresca ou descongeladas a 2-4 ° C, não mais de 3 dias. Fazer a saliva não vórtice e evitar pipetagem mucina que não contém qualquer exsudado soro. Use precauções padrão ao manusear saliva http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .

3. Microplaca Set-up

  1. BUFFER: As medições são realizadas em triplicata. A cada poço de uma placa de microtitulação é adicionado 130 uL de TBS.
  2. AMOSTRAS: Para cada poço de teste, é adicionado 20 uL de saliva para um volume final de 150 uL / poço. Misturar por pipetagem sem a introdução de bolhas.
  3. CONTROLE: O controle positivo contém PPE, mas não saliva. O controlo negativo contém saliva, mas não PPE.To o controlo positivo poço é adicionado 20 uL de TBS. Para o controlo negativo poço é adicionado 20 uL de saliva.
  4. INCUBAÇÃO PPE: Shake PPE solução funcionando bem. Adicionar 50 uL Solução de trabalho de PPE a cada poço excluindo os poços de controlo negativo. Para os poços de controlo negativo, adicionar 50 uL de TBS. Incubar 10 min a 23 ° C.
  5. Incubação do substrato: Adicionar 50 uL SA 3 solução de NA de trabalho para cada poço. Incubar 45 min a 23 ° C.
  6. Coomassie Blue:. Adicionar 50 mL solução Coomassie azul trabalho
  7. Leitura: Ler a absorbância em leitor de microplacas, A 405 nm para detectar SA 3 NA clivagem que representa ativa α 1 PI e A 595 nm para detectar Coomassie Azul, que representa o conteúdo de proteína.

4. Calcule α 1 Índice PI

  1. NORMALIZE média, um 405 nm e um nm 595: Para cada triplicado, calcular a média. Subtrair a média Controle Negativo a partir da média da amostra. Para minimizar placa para a chapa de variação, normalizar as médias por divisão de cada média da amostra pela média Controlo positivo como se segue:

figure-protocol-1

  1. CÁLCULO DO α 1 PI INEX: Divida o normalizado A 405 nm pelos normalizados A 595 nm:

figure-protocol-2

5. Os resultados representativos

Para determinar se o α-teste pode ser adequado para utilização como um teste de rastreio ponto-de-cuidado para monitorar CD4 em endémicas, de recursos limitados regiões, saliva estimulada foi recolhido a partir de 20 fêmeas e 11 machos HIV-1 clínica sujeitos assistir para cuidados de rotina em Camarões. Consistente com observações preliminares durante o desenvolvimento da α-teste usando saliva coletada em Nova York, a α 1 Índice de PI na saliva coletadas em Camarões correlacionados com contagem de CD4 (r 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). A relação foi definida por uma curva sigmoidal 3-parâmetro que é consistente com uma relação dose-resposta (Figura 2A). A confiança de 95% e intervalos de predição são representadas com linhas azuis e vermelhas, respectivamente (Figura 2B).

Emum estudo anterior, verificamos que células T CD4 + apresentam ciclismo sinusoidal com periodicidade de 23 ± 3,5 dias em indivíduos HIV-1 e em indivíduos com a versão herdada de α 1 PI deficiência (PiZZ) 3. Aqui apresentado é um exemplo representativo de computer-generated análise da curva de seno de CD4 de bicicleta em um non-HIV-1 controle saudável exibindo 27 periodicidade dia (Figura 3A).

Gerado por computador análise da curva de seno de as células CD4 + alterações das células T em 6 indivíduos rendeu valores para pico-a-pico de amplitude e eixo de oscilação 3. Como seria de esperar, o eixo de oscilação foi correlacionada com a amplitude (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (Figura 3B). Em pacientes irão CD4 + T contagens de células, as alterações cíclicas na contagem de células CD4 T eram pequenos, e em pacientes com CD4 elevada contagem de células T, alterações cíclicas eram grandes.

Porque olinha de regressão representado na Figura 2 estima o eixo de oscilação eo eixo de oscilação é correlacionada com a amplitude, a amplitude pode ser calculado para a linha de regressão, assim, estimando como muito acima e abaixo das CD4 + de regressão da linha de células T que seria esperado a variar devido à ciclismo (Figura 3C). Sobrepondo a amplitude calculada na Figura 3C e do intervalo de confiança calculado na Figura 2B, verificou-se que a amplitude (linha verde) encontra-se dentro de 95% do intervalo de confiança (linha azul) (Figura 3D).

figure-protocol-3
Figura 1. Resumo Procedimento: ácido cítrico Lugar na boca e coletar saliva. Adicionar saliva diluída a poços de uma microplaca em triplicado. Adicionar PPE a cada poço e incubar durante 15 min a 23 ° C. Adicionar o substrato PPE a cada poço e incubar durante 45 min a 23 ° C. Adicionar Azul de Coomassie e lida a 405 nm para detectar a actividade PPE e a 595 nm para a detecção da proteína.

figure-protocol-4
Figura 2. Comparação da α-teste com o método padrão CD4 enumeração. A) O α-teste foi realizado por quantificação do α 1 Índice PI na saliva estimulada boca todo. Contagens de CD4 foram realizados por um laboratório independente médica por citometria de fluxo padrão. Sangue por citometria de fluxo e saliva foram coletadas na visita clínica mesmo. A relação entre o índice de α PI 1 e as contagens de CD4 foi definida por uma curva sigmoidal de 3 parâmetros (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) A confiança de 95% e intervalos de predição são descritos em azul e vermelho linhas, respectivamente.

figure-protocol-5
Figura 3. Precisão de cálculo CD4 counts usando o Index.A α1PI) células T CD4 + exibiram ciclismo sinusoidal com 27 dias periodicidade de um controlo não-HIV-1 saudável. O eixo de oscilação é descrita (linha pontilhada vermelho). B) COMPUTADOR análise onda gerada seno de CD4 T ciclo celular foi usado para calcular a amplitude pico-a-pico eo eixo de oscilação em 4 de HIV-1, 1 sujeitos não-HIV -1 sujeito PiZZ, e do não-HIV-1 de controlo saudável representado na parte A. A relação entre T CD4 + amplitude da célula e do eixo de oscilação foi definida por 3-parâmetro curva sigmoidal (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) A relação entre a amplitude sigmoidal e eixo de oscilação derivado, em parte B) foi utilizada para calcular a amplitude esperado (linhas verdes) de pontos ao longo da linha de regressão (linha preta) a partir da Figura 2. D) A amplitude esperada intervalo (linhas verdes) foi significativamente diferente do intervalo de confiança de 95% (linhas azuis) tal como determinado pelo Teste de Soma de Mann Whitney Rank (com base numa comparação da diferença média entre o intervalo de confiança de 95% e linha de regressão (63 células / ml) ea diferença entre a linha mediana de amplitude e da linha de regressão (37 células / uL), p = 0,001).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Soro não diluído contém 36 mM mediana α 1 PI e 3,6 mM α macroglobulina 2 (α 2 M) uma diferença de 10 vezes 8. Ambas as proteínas competir para a ligação a PPE. Estas duas características, concentração e PPE afinidade, têm sido exploradas para desenvolver um método que é capaz de medir especificamente α 1 PI no soro normal na presença de competir α 2 M 8. Este método pode detectar tão pouco como 50 nM μ 1 PI no soro de 0,3%. A uma dil...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

A pesquisa foi apoiada pela Harry Winston Research Foundation.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do o reagente de Companhia Número de catálogo
Sialogogo, 0,05 M de ácido cítrico Doces Sugarfree AED, 4900 traseiro N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sugar-Free gotas de limão
Suínos elastase pancreática, tipo 1 (CE 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
Succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida Sigma-Aldrich S4760
Azul Brilhante de Coomassie R-250 Sigma-Aldrich B7920
Da cultura de tecidos tratados, 96 microplacas bem Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
Leitor com filtros para 405 nm e 595 nm MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

Referências

  1. Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
  2. Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
  3. Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
  4. Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
  5. Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
  6. de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
  7. Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
  8. Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
  9. Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
  10. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
  11. LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
  12. Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
  13. WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

ndice de Alpha 1 AntitripsinaEnsaio de Prote na SalivarElastase Pancre tica PorcinaSubstrato Colorim trico SA3NAColora o com Azul de KumasiEnsaio em Leitor de MicroplacasColeta de Saliva EstimuladaTriagem no Ponto de AtendimentoMonitoramento da Doen a por HIV

Artigos relacionados