Ovariectomia e 17β-estradiol substituição em ratos e camundongos: uma demonstração visual

Resumo

Ovariectomia e subsequente substituição do 17β-estradiol, por meio de cápsulas de silastic e Nutella perorai são demonstrados em ratos e ratinhos.

Resumo

Estrogens são uma família de hormonas sexuais femininos com um espectro excepcionalmente ampla de efeitos. Quando os ratos e ratinhos são utilizados na investigação estrogénio são vulgarmente ovariectomizados, a fim de ablação a produção da hormona rapidamente bicicleta, substituindo o exogenamente 17β-estradiol. Há, no entanto, a falta de consenso em relação a como a hormona deve ser administrada para se obter as concentrações séricas fisiológicas. Isto é crucial uma vez que o 17β-estradiol método nível / administração influencia profundamente os resultados experimentais ^1-3. Temos em uma série de estudos caracterizados os diferentes modos de administração 17β-estradiol, encontrando que as cápsulas subcutâneas silastic e por-oral Nutella porca creme-são superiores aos disponíveis comercialmente peletes de libertação lenta (produzido pela empresa Research Innovative da América) e injecções diárias, em termos de produção de fisiológicas concentrações séricas de 17β-estradiol ^4-6. Entre os advantages do método porca creme, que anteriormente foi utilizado para a administração da buprenorfina ^7, é que, quando utilizada para a administração estrogénio que se assemelha a terapia de substituição hormonal perorai e é não-invasivo. As cápsulas subcutâneas silastic são convenientes e produzir as concentrações mais estáveis ​​no soro. Este artigo contém vídeo passo-a-passo demonstrações de ovariectomia e 17β-estradiol reposição hormonal por cápsulas de silastic e Nutella via oral em ratos e camundongos, seguido por uma discussão de aspectos importantes dos procedimentos administrativos.

Protocolo

1. Ovariectomia pela Rota Dorsal

1. Anestesiar o animal, por exemplo, utilizando 1,5% de isoflurano (4% para a indução) em um óxido de oxigénio / nitroso 30% de mistura / 70%. Colocar o animal na posição de bruços em uma placa de aquecimento ligada a um termómetro rectal. É importante ter uma fina camada de isolamento entre o animal e da placa, e que o sistema de termómetro feed-back mantém a temperatura do corpo dentro de 37 ± 0,5 ° C. Aplicar gel de protecção dos olhos e administrar 5 mg de peso corporal Rimadyl / kg diluído em solução salina por via subcutânea no aspecto lateral do pescoço do animal para o alívio da dor pós-operatória.
2. Shave área de 4 * 4 cm (3 * 3 cm para ratos) cephally da crista ilíaca. Lave cuidadosamente a área raspada com por exemplo Jodopax antes de cobrir o animal com uma folha de 4 4 ​​cm * cirurgia de abertura.
3. Faça uma incisão de 2-3 cm da linha média e sem rodeios dissecar a pele da fáscia subjacente. Um cm lateral da linha média, fazer uma outra incisão through a fáscia. Bluntly dissecar lateralmente no âmbito do presente fáscia como superficialmente quanto possível, até atingir a cavidade abdominal.
4. Com uma pinça, pegue o tecido adiposo que rodeia o ovário na cavidade abdominal e puxe-o para fora. Identificar o ovário e ligadura dos cornos uterinos e vasos 0,5-1 cm proximal desta estrutura. Cortar o ovário e tecido adiposo ligados e voltar a colocar a tecido remanescente para dentro da cavidade abdominal. Fazer outra incisão na fáscia contralateral e repita o procedimento.
5. Fechar as feridas, de preferência usando uma sutura de monofilamento, e deixar o animal acordado da anestesia. Colocar o animal numa gaiola aquecida (25-27 ° C) durante pelo menos 2 horas após a cirurgia. Os animais devem ser alojados separadamente os primeiros dias pós-operatório. É fundamental que a gaiola é frequentemente limpas / substituídas durante a fase de recuperação. Vinte e quatro horas após a cirurgia, os animais injectar por via subcutânea com outro 5 mg de peso corporal Rimadyl / kg diluído emsolução salina.

2. A administração subcutânea de 17β-estradiol através Cápsulas Silastic

1. Misturar bem a quantidade desejada de 17β-estradiol em óleo de sésamo. Para concentrações fisiológicas em ratos e ratinhos, recomendamos 180 mcg / mL e 18-36 mcg / mL, respectivamente. As cápsulas de placebo são preenchidos com óleo de sésamo puro.
2. Corte 3 cm (2 cm para ratos) comprimentos de tubos de silastic e 5 mm (3 mm para camundongos) comprimentos de varas aplicador de madeira para ligar. Usando uma pinça, espremer uma tomada de madeira no interior da cápsula de silastic antes de injectar a solução de óleo 17β-estradiol/sesame para encher todo o comprimento. Suavemente tampar a cápsula de silastic na extremidade aberta com uma outra tomada de madeira (os tampões devem permanecer permanentemente na cápsula). Incubar as cápsulas na solução 17β-estradiol remanescente durante a noite antes do implante.
3. Implante da cápsula pode ser realizada durante a anestesia utilizada em ovariectomia em ratos. Para mice, no entanto, um período de recuperação de 14-dias após a ovariectomia é fortemente recomendada para minimizar o risco da cápsula saliente através da pele frágil.
4. Após as preparações cirúrgicas como na 1.1, ou após o fechamento da incisão ovariectomia, fazer a barba e lavar a 2 * A área de 2 cm no dorso do pescoço do animal. Faça uma incisão de 1 cm e sem rodeios dissecar uma bolsa subcutânea caudolaterally, com amplo espaço para a cápsula. Seque a cápsula de silastic (que, até este ponto do tempo foi incubado na solução de 17β-estradiol) e suavemente instalar-lo através da incisão, a qual é subsequentemente fechado por uma sutura. É essencial para se certificar de que as estirpes de cápsula pele a tão pouco quanto possível, particularmente na área próxima da ferida. Desde a produção de cápsulas para a implantação, é importante que a contaminação é evitada.

3. Administração perorai de 17β-estradiol através da Nutella Nut creme-

1. A dissolução completa 17β-estradiol em óleo de gergelim, e em seguida, misture o óleo de gergelim com a Nutella. Sugerimos que cada porção diária contém 28 ug 17β-estradiol, 5 uL de óleo de sésamo e 1 Nutella g por quilograma de peso corporal para os ratos e 1,12 ug 17β-estradiol, 0,312 óleo de sésamo e 60 uL Nutella mg por cada rato 30-g. Placebo porca creme-se preparado de forma idêntica excepto sem a 17β-estradiol.
2. Treinar os animais para comer sem hormônios porca creme para cinco dias anteriores ao experimento. Os três primeiros dias de treinamento, os ratos devem ser otimamente treinados em grupos (aproximadamente 0,5 g de Nutella 2-5 animais), em gaiolas de origem. Nos quarto e quinto dias de treinamento, os animais são colocados em gaiolas separadas antes de receber a porção diária para assemelhar-se a situação experimental.
3. Durante a experiência, os animais são colocados em gaiolas separadas para cada ocasião de alimentação, após o que a porção Nutella é servido em pequenas azulejos de cerâmica. Se a formação foi realizada como acima, oexperiência ur é que mais de 95% dos ratos e ratinhos aceitar a porca de creme, e uma vez totalmente habituado, a maioria dos animais consomem-lo dentro de segundos.

4. Os resultados representativos

Soro fisiológico 17β-estradiol concentrações, que os métodos actuais destinados a reproduzir, são aproximadamente 5-140 pg / mL para ratos e 5-35 pg / mL para ratinhos ^4,6. As cápsulas subcutâneas silastic de acordo com as instruções acima, quando administrado a 300 g fêmeas Sprague-Dawley, produzir diminuição lenta 17β-estradiol concentrações de soro de cerca de 40 pg / mL dia 2 ao 10 dia pg / mL 35. No entanto, imediatamente após a administração, um pico de concentração no soro de cerca de 1000 pg / mL pode ser esperado, caindo para a gama fisiológica dentro de 8 horas (Figura 1A) ^4,5. As cápsulas de silastic para ratinhos descritos acima, com 36 ug 17β-estradiol/mL, quando administrada a 25 g fêmea C57BL / 6, tornam conc soroentrations que diminuem lentamente a partir de aproximadamente 90 pg / mL dia 2-25 pg / mL dia 35. Isto é provavelmente precedido por um pico semelhante como foi encontrado nos ratos, embora isso não tem sido investigada (Figura 1B) ^6.

O método Nutella perorai com as dosagens acima descrito, quando administrado a 300 g fêmeas Sprague-Dawley, torna níveis fisiológicos de 17β-estradiol com flutuações diárias entre 10-70 pg / mL (Figura 2A) ^4. Para ratinhos usando a dosagem acima, os níveis diários flutuar entre aproximadamente 20 e 120 pg / mL (Figura 2B) ^6.

. Rong> Figura 1 gráficos que apresentam estilizados 17β-estradiol concentrações em ratos (A, n = 10 em vez de pontos até 24 h, n = 15 em posteriores de tempo pontos) ^4,5 e ratinhos (B, n = 10) ^6, após o implante de cápsula. As cápsulas de silastic produzir um pico inicial curta das concentrações séricas de até 1000 pg / mL, mas diminuem dentro de horas para níveis inferiores a 100 pg / mL. Para as próximas semanas 4-5, as cápsulas rendimento estável, embora constantemente decrescente, as concentrações séricas. As áreas sombreadas correspondem a fisiológicas 17β-estradiol concentrações no soro em ratos fêmeas intactos e ratinhos, respectivamente. Mesmo que não visualmente demonstrado nos gráficos, há variabilidade inter-individual nas concentrações 17β-estradiol, tornando os coeficientes de variação de 27-183%, em ratos e de 28 a 115% em ratos com o método de cápsula de silastic (média muito baixa concentrações muitas vezes geram altos coeficientes de variação).

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A Figura 2 gráficos que apresentam estilizados 17β-estradiol concentrações em ratos (A, n = 15). ⁴ e ratinhos (B, n = 10) ⁶ como uma consequência da administração hormona diariamente em Nutella. O método processa Nutella perorai picos diários, no entanto, de longe, não tão elevada como produzido por via subcutânea ou métodos intravenosas. Este imita a farmacocinética da terapia de substituição hormonal humano, eo tratamento perorai pode prosseguir durante o tempo que for necessário, mesmo se o exemplo acima apresentar apenas um período inicial de 96 horas. As áreas sombreadas correspondem a fisiológicas 17β-estradiol concentrações no soro em ratos fêmeas intactos e ratinhos, respectivamente. Mesmo embora não visualmente demonstrado nos gráficos, há variabilidade inter-individual nas concentrações 17β-estradiol, tornando os coeficientes de variação de 40-132%, em ratos e de 13 a 219% em ratos com o método Nutella (muito baixas concentrações médias muitas vezes geram altacoeficientes de variação).

Discussão

As formas de administração apresentadas acima têm em estudos anteriores mostraram-se superiores a comerciais de libertação lenta e as injecções de peletes em termos de produção de fisiológicas concentrações séricas de 17β-estradiol. Enquanto pelotas liberação lenta produzir muito altas e prolongadas picos de concentração de soro, as injeções causam extremos, as flutuações hormonais diárias e exigem manuseio repetido estressante dos ^4-6 animais. A importância da escolha de modos de administração adequada é rea...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Rimadyl, 50 mg / mL	Pfizer	462986	Analgesia pós-operatória após a ooforectomia.
Lubrithal gel para os olhos	Leo Laboratories		Proteção dos olhos durante a cirurgia.
Vet Jodopax	Pharmaxim		Desinfecção cirurgia.
Sutura Vicryl 4-0	Johnson & Johnson		A sutura e ligadura do ovário.
17β-estradiol,%> 98	Sigma	E8875-1G	Em óleo de gergelim para cápsulas de silastic e Nutella.
Óleo de gergelim	Sigma	S3547-1L	Dissolvendo o 17β-estradiol.
Tubo de Silastic, ID / OD: 1.575/3.175 milímetros	A Dow Corning	508-008	Produção de cápsulas de silastic.
Vareta aplicadora de madeira	Selefatrade	12-0783	Nivelamento das cápsulas de silastic.
Nutella	Ferrero		Médio para peroral 17β-estradiol.