$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
A pesquisa extensiva tem forneceram evidências que sugerem que a proteína amplos dobrando na célula é um processo de co-translacional 1-5. No entanto, o caminho exato que cadeia polipeptídica segue durante a co-traducional dobrar para atingir sua forma funcional ainda é um enigma. A fim de compreender este processo e para determinar a conformação exacta dos intermediários de co-translacionais de dobragem, é essencial ao desenvolvimento de técnicas que permitem o isolamento de RNC que transportam cadeias nascentes de tamanhos pré-determinados para permitir a sua posterior análise estrutural.
SECM (monitor secreção) é um aminoácido 170 E. coli proteína que regula a expressão do jusante SecA ATPase (condução secreção) no operão SECM-seca 6. Nakatogawa e Ito originalmente descobriu que uma sequência de aminoácidos 17 de comprimento (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) na região C-terminal da proteína SECM são necessários e suficientes paracausar bloqueamento dos alongamento SECM em Gly165, produzindo assim peptidil-glicil-tRNA estavelmente ligado ao ribossoma P-site 7-9. Mais importante, verificou-se que esta sequência de aminoácidos 17 de comprimento pode ser fundido com o terminal C de virtualmente qualquer proteína de comprimento completo e / ou truncado, permitindo assim a produção de RNC que transportam cadeias nascentes de tamanhos pré-determinados 7. Assim, quando fundidos ou inserida na proteína alvo, SECM sequência stalling produz prisão do alongamento da cadeia polipeptídica e gera RNC estáveis tanto in vivo em E. células de Escherichia e in vitro num sistema isento de células. Centrifugação em gradiente de sacarose é ainda utilizado para isolar RNC.
Os RNC isolados podem ser utilizados para analisar as características estruturais e funcionais dos intermediários de co-translacionais dobráveis. Recentemente, esta técnica tem sido usada com sucesso para obter insights sobre a estrutura de vários ribossomas ligados a cadeias nascentes 10,11. Aqui nós descrevemos o isolamento de bovinos Gamma-B cristalina RNCS fundido a SECM e gerado em um sistema de tradução in vitro.