Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Resumo

Os vírus da gripe replicar seu genoma de RNA em associação com a célula hospedeira da cromatina. Aqui, apresentamos um método para purificar intactos os complexos de ribonucleoproteínas virais da cromatina das células infectadas. Purificou complexos virais podem ser analisados ​​por Western blot e tanto de extensão do primer de proteína e do conteúdo de ARN, respectivamente.

Resumo

Como todos os vírus de RNA fita negativa-, o genoma dos vírus da gripe é embalado na forma de complexos de ribonucleoproteína virais (vRNP), em que o genoma de cadeia simples é encapsidado pelo nucleoproteína (NP), e associada com o complexo trimérico polimerase consistindo da PA, PB1, PB2 e subunidades. No entanto, em contraste com a maioria dos vírus de ARN, os vírus influenza realizar a síntese de RNA viral nos núcleos das células infectadas. Curiosamente, a síntese de mRNA virai utiliza celulares pré-mRNAs como iniciadores, e tem sido proposto que este processo tem lugar em cromatina ^1. As interacções entre a polimerase virai e do hospedeiro a RNA polimerase II, bem como entre NP e nucleossomas hospedeiras foram também caracterizados ^1,2.

Recentemente, a geração do vírus da influenza recombinantes que codificam um One-Strep-Tag geneticamente fundido com o terminal C da subunidade PB2 da polimerase virai (rWSN-PB2-Strep ^3), seren descrito. Estes vírus recombinantes permitem a purificação de PB2 contendo complexos, incluindo vRNPs, a partir de células infectadas. Para obter purificado vRNPs, culturas de células são infectadas, e vRNPs são purificados por afinidade a partir de lisados ​​derivados a partir destas células. Contudo, os procedimentos de lise utilizadas até à data têm sido baseados em um-passo de lise de detergente, o qual, apesar da presença de uma nuclease geral, muitas vezes extrair cromatina-bound único material de forma ineficiente.

O nosso trabalho preliminar sugeriu que uma grande porção de vRNPs nucleares não foram extraídos durante a lise das células tradicional, e, portanto, não poderia ser purificado por afinidade. Para aumentar este eficiência de extracção, e para separar cromatina-ligado a partir de não-ligados a cromatina vRNPs nucleares, adaptado um passo a passo do protocolo de extracção subcelular para influenza células infectadas por vírus. Resumidamente, este procedimento primeiro separa os núcleos a partir da célula e, em seguida, extrai solúveis proteínas nucleares (aqui denominado "a fracção nucleoplasmic").O material insolúvel remanescente nuclear é então digerido com Benzonase, um DNA inespecífica / RNA nuclease, seguido de dois passos de extracção de sal: em primeiro lugar utilizando 150 mM de NaCl (denominado "CH150"), em seguida, NaCl 500 mM ("ch500") (fig. 1 ). Estes passos de extracção de sal foram escolhidos com base na nossa observação de que 500 mM de NaCl foi suficiente para solubilizar mais de 85% de vRNPs nucleares e ainda assim permitir a ligação de vRNPs etiquetados para a matriz de afinidade.

Após fraccionamento subcelular das células infectadas, é possível purificar afinidade vRNPs pB2-marcados a partir de cada fracção individual e analisar a sua proteína e os componentes de RNA utilizando Western Blot e extensão do iniciador, respectivamente. Recentemente, utilizou este método para descobrir que vRNP exportação formar complexos durante pontos finais após a infecção sobre a fracção de cromatina extraiu-se com 500 mM de NaCl (ch500) ^3.

Protocolo

Um fluxograma esquemático do protocolo é mostrado na fig. 1 e uma tabela de reagentes é apresentada abaixo.

1. Infecção (16 - 24 h)

1. Semente para fora células HeLa em 5 de 150 mm pratos de plástico de células de cultura em meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM)-elevado médio de glicose, de modo que eles atingem cerca de 80% de confluência no dia seguinte (aproximadamente 5 x 10 células ^8). É importante que as células não chegar a 100% de confluência.
2. No dia seguinte, diluir a Strep-etiquetados com estoque de vírus influenza em salino tamponado com fosfato (PBS) contendo 0,3% de albu....

Discussão

Enquanto muitos estudos foram recentemente identificadas proteínas individuais ou redes celulares envolvidos na infecção por vírus influenza virus ^8, o significado funcional da maioria destas interacções permanece obscura. Dada a dependência absoluta de cromatina funções baseadas para a síntese de RNA vírus influenza e da natureza complexa biofísicas e bioquímicas do núcleo ^9, as novas técnicas serão necessários para elucidar estas funções. O fraccionamento subnuclear apresentamos aqui, juntamente .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DMEM de alto glicose	Gibco	11965-092
BSA	Sigma	A9418
Inibidor da protease da mistura G	Serva	39101
Benzonase Nuclease	Novagen	71206	25 U / uL
DNase I, livre de RNase	ThermoScientific	EN0523	50 U / uL
Dounce homogeneizador	Wheaton	432-1271	Use tipo "B" pilão
Strep-Tactin Sepharose	IBA GmbH	2-1201-025	Formato de coluna de 50% de suspensão também pode ser usado
Desthiobiotin	IBAGmbH	2-1000-002