Artigo de método

Um Modelo de Tubo de Falópio Humanos para Investigação de

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DOI:

10.3791/4036

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11 de agosto de 2012

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um Ex vivo infecção Modelo para a visualização de interações diretas de patógenos bacterianos com células de trompas. O modelo de tecido inteiro órgão foi estabelecido para investigar C. trachomatis Patologia induzida ao tubo de falópio feminino em "life-like" condições.

Resumo

Infecções do trato genital por Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) são as mais freqüentes doenças sexualmente transmitidas em mulheres em todo o mundo. Depuração ineficiente ou persistência dos patógenos pode levar a infecções ascendentes do trato genital e é suposto causar danos inflamatória crônica de 1,2 tecidos infectados. Como consequência, sequelas clínicas graves como a doença inflamatória pélvica (DIP), oclusão tubária e infertilidade pode ocorrer 3,4.

A maioria das pesquisas com C. trachomatis foi conduzida em linhas de células epiteliais (por exemplo, células HEp-2 e HeLa-229) ou em ratinhos. No entanto, como com a célula de cultura de modelos baseados, eles nem reflectir a fisiologia do tecido nativo nem a patofisiologia da C. infecções do tracto genital trachomatis in vivo 5. Limitações adicionais são dadas pelo facto de cascatas de sinalização centrais (por exemplo IFN-γ MEDIATed JAK / STAT via de sinalização) que controlam o crescimento intracelular por clamídia diferem fundamentalmente entre ratos e seres humanos 6,7. Nós e os outros, portanto, estabeleceu um conjunto de órgãos modelo trompa de Falópio para investigar interações diretas entre C. trachomatis e humano da trompa de Falópio ex vivo de células 8,9.

Para este efeito, humanos trompas de Falópio de mulheres submetidas a histerectomia foram recolhidas e infectados com C. trachomatis serovar D. Dentro de 24 h após a infecção amostra, onde analisadas em microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para detectar Chlamydia trachomatis mediada dano epitelial, bem como C. formação trachomatis inclusão no tecido de Falópio.

Protocolo

1. Preparação de Chlamydia trachomatis Ações D Serovar

  1. Infect confluente 175 centímetros 2 balão de cultura de células HeLa contendo-229 células com 4 ml C. D trachomatis no SPG buffer.
  2. Incubar durante uma hora a 37 ° C durante agitação constante.
  3. Adicionar 20 ml de DMEM com FCS 10% e 240 uL Cicloheximida.
  4. Incubar numa incubadora humidificada durante 48 h, a 37 ° C e 5% de CO 2.
  5. Adicionar 5 ml pérolas de vidro estéreis, agitação forte para retirar e destruir C. trachomatis abrigando HeLa-229 células.
  6. Recolher o sobrenadante e adicionar mais 5 ml de pérolas de vidro estéreis.
  7. Rocha três vezes durante 1 min para destruir todas as células HeLa-229 e libertação C. trachomatis.
  8. Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI e 4 ° C para se livrar de detritos celulares.
  9. Recolher o sobrenadante para a infecção de 8 a 10 175 cultura de células cm 2 balões g confluenterown com HeLa 229 células.
  10. Incubar a cada frasco com 4 ml de tampão SPG e 4 ml de sobrenadante infecção anterior durante uma hora a 37 ° C com agitação constante.
  11. Depois de uma hora adicionar 15 ml de DMEM com FCS 10% e 230 uL cicloheximida seguido por 48 h de incubação a 37 ° C e 5% de CO 2.
  12. Adicionar 5 ml pérolas de vidro estéreis, agite para retirar e destruir C. trachomatis abrigando HeLa-229 células.
  13. Recolher o sobrenadante e adicionar mais 5 ml de pérolas de vidro estéreis.
  14. Rocha três vezes durante 1 min para destruir todas as células HeLa-229 e libertação C. trachomatis.
  15. Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI a 4 ° C para se livrar de detritos celulares.
  16. Recolher o sobrenadante.
  17. Encha 40 ml de sobrenadante em tubos de 50 ml Falcon, centrifugar durante 99 min com 11.000 RPMI.
  18. Após centrifugação descartar o sobrenadante e lava-se o sedimento com 1 ml de tampão SPG.
  19. Homogeneizar asedimento em 1 ml e SPG uL alíquota de 20 em um 1 5 ml, tubo Eppendorf loja, a -70 ° C até à utilização. A actividade biológica do stock preparada foi confirmada em uma estabelecida HeLa-229 modelo de infecção da célula.

2. Preparação da trompa de Falópio Humanos

  1. Armazenar humanos trompas de Falópio (HFT) de mulheres submetidas a histerectomia imediatamente após a cirurgia em RPMI contendo FCS a 5% sem antibióticos em 4 ° C até preparação. O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Lübeck (09-153). As mulheres incluídos no estudo (idade 34 até 53) não tinha história de C. antes trachomatis infecção. Tecido das trompas de Falópio foi coletada no periparto de esterilização, a pedido da mãe durante a cesariana ou durante histerectomias devido a fibróides uterinos sintomáticos na fase lútea. Todos HFT foram negativas para o C. trachomatis por PCR.
  2. Dissecar a HFT numa placa de Petri contendo meio RPMI com5% de FCS sem antibióticos. Durante o processamento todo o tecido deve ser submersa em meios para evitar a secagem.
  3. Corte e descarte do tecido conjuntivo e tecido destruído durante a cirurgia.
  4. Após a dissecção abrir o HFT cuidadosamente com um bisturi de pequeno porte.
  5. Para mais experiências preparar pedaços de tecido no tamanho de 0,5 cm x 0,5 cm até 1 cm x 1 cm.
  6. Para a infecção espécime HFT loja em 1 ml de RPMI contendo FCS 5% sem antibióticos. Espécimes HFT foram infectadas com 5.5x10 5 IFU (unidades formadoras de inclusão) de C. trachomatis.
  7. Incubar espécime HFT em 37 ° C, 5% de CO 2 e 21% de O 2, bem como em 37 ° C, 5% de CO 2 e 2% de O2 durante 24 h.
  8. Após período de incubação coletar amostra e loja em fixador Monti para pelo menos três dias a 4 ° C até SEM / TEM preparação.

3. Preparação de amostras para TEM HFT

  1. ParaMET remover espécime de fixador Monti e cortar 2 x 2 mm a 4 x 5 pedaços mm. O tecido restante pode ser utilizada para MEV.
  2. Lavar peças com tampão de cacodilato de sódio, pH 7,35 para 1 h.
  3. Incubar em 1% (w / v) de tetróxido de ósmio em água destilada. durante a noite.
  4. Remover o excesso de tetróxido de ósmio por lavagem min 6x5 em tampão de cacodilato de sódio, pH 7,35.
  5. Remover a água por incubação em concentrações crescentes de etanol em água (v / v) (30% durante 2 h, 40% durante 2 h, 50% durante 2 h, 60% durante 2 h, 70% durante a noite, 80% para 2 h, 90% durante 1 h, 95% durante 1 h, 100% durante 1 h.
  6. Lavar a etanol para 2 x 15 min em óxido de propileno e subsequentemente transferidos para uma mistura de 50% (v / v) araldite recentemente preparado (incluindo todos os componentes) em propileno e incubar durante a noite.
  7. Transferência para araldite preparada de fresco (incluindo todos os componentes) durante pelo menos 1 h.
  8. Transferir para moldes de incorporação de planos e preencher com araldite.
  9. Deixe endurecer por aralditepelo menos 48 horas a 60 ° C
  10. Após o corte da amostra incorporado corte semi cortes finos (700 nm) em um ultramicrótomo usando facas de vidro ou uma histo faca de diamante e manchar com mancha de Richardson.
  11. Corte cortes ultrafinos de (aprox. 70 nm), utilizando uma faca de diamante e transferência para grades de cobre (por exemplo 150 mesh quadrado).
  12. Stain ultra-finas secções com acetato de uranilo a 0,5% (w / v) em água destilada. seguido por 3% (w / v) de citrato de chumbo em água destilada. em um Stainer secção automático. Alternativamente, as secções podem ser corados manualmente, deixando grades 15 min em uma solução saturada de acetato de uranilo centrifugada em água destilada. seguido por citrato de chumbo 0,3% (w / v) em água destilada.

4. Preparação da amostra HFT para MEV

  1. Para remover SEM amostra de fixador Monti, orientar com epitélio voltado para cima em uma folha de cortiça 1,5 x 1 cm e fixar a posição usando agulhas de insetos.
  2. Transferência espécime em cortiça para cestos metálicos adequados elave durante 30 min em tampão de cacodilato de sódio, pH 7,35.
  3. Remover a água por incubação de amostra em concentrações crescentes de acetona / água misturas (v / v) 30% durante 6 h, 40% durante 6 h, 60% durante 8 h, 70% durante a noite, a 80% durante 2 h, 90% para 2% e 100 h durante a noite (ser extremamente cautelosos para manter espécime continuamente submerso).
  4. Transferência para acetona a 100% fresco e amostra seca por secagem por ponto crítico (temperatura 40 ° C, pressão 80 bar).
  5. Remover as agulhas, cortiça e espécimes cola com o epitélio voltado para cima sobre SEM montagem exemplar equipado com um guia de carbono condutora utilizando cimento de carbono condutora. Use prata condutora de líquido para aumentar a condutividade entre o suporte ea guia de carbono condutora.
  6. Preparar um revestimento de ouro, platina ou paládio condutora da amostra, utilizando um revestidor por crepitação.

5. A coloração do Semi Seções finas com Stain Richardson

  1. Vamos semi seções finas seca em slide.
  2. Stain secções com coloração solução a 60 ° C durante 1-2 min.
  3. Lave em água destilada.
  4. Trechos secos e lamela.

6. Os resultados representativos

Dentro do modelo de infecção da trompa de Falópio humano fomos capazes de visualizar as diferenças na morfologia epitelial entre os controles não infectados (Figura 1) e do C. trachomatis - tubos infectados (Figura 2) sob condição normóxica. Característicos diferenças morfológicas implícita patógeno induzida por inchaço e lise de células epiteliais de trompas que não puderam ser detectados em controlos não infectados. Usando meias seções delgadas e microscopia eletrônica de transmissão pudemos provar C. intracelular formação trachomatis inclusão no tecido infectado ex vivo tubo falópico humana (Figura 3, 5), mas não em controles não infectados (Figura 4). Como concentração de oxigênioções no trato genital feminino já são baixas em condições fisiológicas 11, e diminui ainda mais durante um processo inflamatório que também investigou o nosso modelo sob condições de hipóxia. Os resultados preliminares indicam que o modelo é útil para analisar o crescimento clamídia e descendentes em diferentes concentrações de oxigênio. Chlamydia induzida danos em células epiteliais tem de ser separado de artefactos que são mediadas através da preparação e manuseamento descuidado das trompas de Falópio antes da infecção (Figura 6).

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Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de uma Falópio não infectado humano após um dia de incubação em meio de controle (seta verde mostrar ciliado célula seta azul mostra não-ciliado célula).

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Figura 2. Eletrônica de varredura micros cópia de varredura (MEV) de um ex C. trachomatis vivo infectado trompa de Falópio humana uma infecção pós dia (seta branca inclusão marca de ruptura).

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Figura 3. Semi lâminas delgadas mostram típicas inclusões intracelulares (setas brancas) 1d após a infecção do tubo de falópio humana com C. ex vivo trachomatis.

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Figura 4. Microscopia de transmissão de electrões (TEM) de um não-infectada tubo falópico humano após uma incubação dias em meio de controlo.

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A Figura 5 microscopia electrónica. De transmissão (TEM) de uma ex vivo C. trachomatis infectado trompa de Falópio humana uma infecção pós dia (setas brancas marcar inclusões clamídia).

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Figura 6. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) do epitélio trompa de Falópio danificada através da preparação e manuseio descuidado de amostra (branco setas marca destruído o tecido epitelial).

Discussão

Visualização do patógeno-induzido dano ao tecido infectado é árdua e muitas vezes limitado a procedimentos experimentais em camundongos. Nós estabelecemos um modelo de infecção ex vivo em humanos trompas de Falópio para analisar C. infecções do tracto trachomatis fêmea genital superior. Através da utilização deste método, fomos capazes de visualizar C. trachomatis - dano induzido ao epitélio humano tubo de falópio dentro de uma infecção pós dia. Edema celular e lise eram típicas alterações morfológicas que foram observados em C. trachomatis - infectadas trompas de Falópio, mas não em controlos não infectados. Análises em MET revelaram que clamídias implementar um ciclo típico de desenvolvimento intracelular nos tecidos infectados, mostrando inclusões de grande porte com re diferenciadas corpos elementares, mas também inclusões menores, com corpos reticulados ampliadas que podem indicar a persistência. No entanto, o quadro morfológico sozinho não é suficiente para discriminar entre replinfecções icating e persistentes, que são caracterizadas por metabolismo reduzido e uma maior resistência aos agentes antimicrobianos 10.

Destruição do epitélio de infectados trompas de falópio ou é devido ao rompimento de C. trachomatis - infectadas células epiteliais após a conclusão do ciclo de desenvolvimento intracelular e libertação de infecciosas corpos elementares ou a libertação de citoquinas pró-inflamatórias 8. Induzida por patógeno dano tecidual e de acolhimento induzidas reações imunes contra C. trachomatis devem ser os principais fatores que levam à perda da função das células epiteliais, fibroblastos e remodelação infertilidade tubária, finalmente, in vivo 8,11.

Uma das principais limitações deste modelo é a ausência de células inflamatórias que dificulta a análise dos efeitos secundários para o C. inicial trachomatis infecção do epitélio trompa de Falópio. No entanto, o modelo é apquada para investigar diferentes condições ambientais (por exemplo, o teor de oxigénio) e da resposta do hospedeiro-imune inicial em C. aguda trachomatis 8,9. Existem planos para se estabelecer um modelo para testes de antimicrobianos contra C. trachomatis em toda humanos trompas de falópio e caracterizar os estados metabólicos dos diferentes estágios de desenvolvimento observadas no epitélio das trompas por 2-fótons microscopia de varredura a laser.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela DFG-Cluster de Excelência "Inflamação na Interfaces" (RA-Se, RA-D). Somos gratos pela excelente assistência técnica de Kristin Wischnat.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cicloheximida Sigma - Aldrich
SPG Tampão vário veja a receita abaixo
Fixador Monti vário veja a receita abaixo
tampão de cacodilato de sódio vário veja a receita abaixo
Richardson da mancha vário veja a receita abaixo

Receitas:

1. SPG Tampão

  1. Adicionar 75 g de sacarose.
  2. Adicionar 2,47 g de fosfato dissódico.
  3. Adicionar 0,36 g de fosfato monossódico.
  4. Adicionar 0,72 g de ácido glutâmico.
  5. Preencha a 1 l com água destilada.
  6. Ajustar o pH a 7,3.

2. 0,1 M de tampão cacodilato de sódio, pH 7,35.

  1. Adicionar 42,80 g dimethylarsenic sal sódico do ácido.
  2. Adicionar 68,46 g de sacarose.
  3. Preencha a 1 l com água destilada. para obter 0,2 M tampão de cacodilato de sódio.
  4. Antes de usar solução diluída com água destilada. a desejada concentração e ajustar o pH a 7,35, se necessário.

3. Fixador Monti

  1. Adicionar 156 ml 0,12 M de tampão cacodilato de sódio. 3,2 Adicionar 25 ml glutaraldeído 25% em água destilada.
  2. Adicionar 19 mlParaformaldeído 10% em água destilada.
  3. Adicionar 3 ml de 3% CaCl 2 em água destilada.
  4. Ajuste o pH para 7,35 e encha com água destilada. a 312 ml de solução final.

4. Richardson mancha

  1. Misturar partes iguais de azul de metileno a 1% em solução aquosa a 1% de bórax e 1% Azur II em água destilada.

Referências

  1. Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping. J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).
  2. Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility. Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).
  3. Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).
  4. Mardh, P. A. Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).
  5. Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells. Mol. Cancer. 5, 55 (2006).
  6. Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells. Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).
  7. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  8. Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection. Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).
  9. Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).
  10. Wyrick, P. B., Knight, S. T. Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin. J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).
  11. Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring. Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).

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