Identificação de complexos de proteínas em Escherichia coli Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Summary

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a bactéria Escherichia coli Que pode ser usado para isolar e caracterizar estáveis ​​múltiplos complexos proteína-à homogeneidade a partir de perto mesmo números de cópias baixos por célula.

Abstract

Uma vez que a maioria dos processos celulares são mediadas por montagens macromoleculares, a identificação sistemática de interacções proteína-proteína (PPI) e à identificação da composição de subunidades de vários complexos de proteína pode fornecer informações sobre a função do gene e aumentar a compreensão dos sistemas biológicos ^{1 e 2.} Interacções físicas podem ser mapeados com alta confiança isolamento vialarge escala e caracterização de complexos de proteínas endógenas sob condições fisiológicas quase baseados em purificação de afinidade de proteínas cromossomicamente etiquetados em combinação com espectrometria de massa (STDA). Esta abordagem tem sido aplicada com sucesso em organismos evolutivamente diversas, incluindo levedura, moscas, vermes, células de mamíferos e bactérias ^1-6. Em particular, têm gerado um carboxi-terminal Affinity Peptide seqüencial (SPA) sistema de marcação dupla para afinidade com purificação de complexos de proteínas nativas cultivadas coli gram-negativas coli, usando genetically-tratáveis ​​hospedeiras estirpes laboratoriais que estão bem adaptados para as investigações do genoma da biologia fundamental e processos conservadas de procariotas ^{1, 2, 7.} O nosso sistema de SPA-marcação é análogo ao método de purificação por afinidade em tandem desenvolvido originalmente para levedura ^{8, 9,} e é composto por uma ligação peptídica a calmodulina (CBP), seguido do local de clivagem para a protease altamente específico do tabaco vírus etch (TEV) e três cópias do epitopo FLAG (FLAG 3X), permitindo dois ciclos consecutivos de enriquecimento por afinidade. Após a amplificação da cassete, a sequência específica de produtos lineares de PCR que codificam o SPA-tag e um marcador de selecção são integradas e expressas em quadro como carboxi-terminais fusões em um fundo DY330 que é induzida a expressar transitoriamente um altamente eficiente sistema de recombinação heteróloga bacteriófago lambda ^10. Purificação de dupla etapa subsequente utilizando calmodulina e grânulos anti-FLAG de afinidade permite a altamente selectivoe recuperação eficiente de até complexos de baixa abundância de proteínas de grande escala culturas. Espectrometria de massa é, então, usado para identificar as estavelmente co purificação de proteínas com uma sensibilidade elevada (limites de detecção baixos de nanogramas).

Aqui, descrevemos detalhadas passo-a-passo os procedimentos que comumente utilizam para purificação de proteínas sistemática de marcação, e espectrometria de massa com base em análise de complexos de proteínas solúveis de E. coli, que podem ser expandidos e potencialmente adaptada para outras espécies bacterianas, incluindo certos agentes patogénicos oportunistas que são passíveis de recombineering. As interações físicas resultantes muitas vezes pode revelar interessantes componentes inesperados e conexões sugerindo novas ligações mecanicistas. Integração dos dados do PPI com alternativas de associação de dados moleculares, como genéticos (gene-gene) interações e genômica de contexto (GC) previsões podem facilitar a elucidação da organização global molecular de proteínas multi-complexos dentro bicaminhos fisiológicos. As redes geradas por E. coli pode ser usado para obter insights sobre a arquitetura funcional de produtos de genes ortólogos em outros micróbios para que anotações funcionais actualmente não existem.

Protocol

1. Construção de Gene-específico SPA-marcação em E. Strain coli DY330

1. O plasmídeo pJL148 compreendendo a sequência de DNA SPA-tag e o cassete de canamicina marcador de resistência aos antibióticos (Kan ^R) são usadas como um modelo na reacção de polimerização em cadeia (PCR) ^7. A 45 nt iniciador específico do gene para a frente, localizado imediatamente a montante do codão de paragem do gene alvo em enquadramento com um 27 ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) iniciador tag pb específica para a frente, e a 45 nt de primer reverso específico do gene, localizado imediatamente a jusante do codão de paragem do gene....

Results

Uma vez que as proteínas de isca marcadas, que são expressas em níveis endógenos, são purificadas por afinidade a partir de culturas de fase logarítmica, as amostras foram executadas em um gel de coloração de prata para visualizar os componentes polipeptídicos individuais dos complexos estáveis isolados. Também submetemos uma segunda porção das amostras de proteína purificada por afinidade à espectrometria de massa em tandem sem gel (LCMS) para identificar as sequências polipeptídicas correspondentes. A eficácia deste pr.......

Discussion

Um aspecto chave da abordagem baseada em STDA SPA descrito aqui, é que a marcação é feita dentro do contexto natural cromossómica, assegurando desse modo a regulação do gene normal é mantida (isto é. Isca promotor nativo conservado, portanto os níveis de expressão não é perturbada) e estavelmente nativo associado complexos de proteínas são recuperadas em quase endógenos níveis. Problemas de polaridade operão também são evitados mediante a inclusão de um promotor de orientada para o exterior do marcador seleccio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antibióticos
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicilina	Bioshop	#AMP201
2. Meio de caldo fantástico
Bio-Triptona	Bioshop	#TRP 402
Extrato de levedura	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
3. Cepa bacteriana e plasmídeo
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
4. Reagentes de PCR e Eletroforese
Taq DNA polimerase	Fermentas	# EP0281
10 X tampão PCR	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Carregando corante	NEB	#B7021S
Brometo de etídio	Bioshop	# ETB444
10X TBE tampão	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Ácido bórico	Bioshop	#BOR001
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Sigma	# E6768
DNA	ladder NEB	#N3232L
5. Kits de isolamento e limpeza de plasmídeos
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR kit de purificação	Qiagen	#28104
6. Equipamentos de PCR e Transformação
Termociclador	BioRad	iCycler
Eletroforese em gel de agarose	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
Cubeta de eletroporação de 0,2 cm	Bio-Rad
42 ° Agitador em banho-maria		C Innova 3100
Centrífuga Beckman Coulter TJ-25	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 ° C Shaker	New Brunswick Scientific, EUA
32 ° C grande Shaker	New Brunswick Scientific, EUA
32 ° Incubadora de placa C	Fisher Scientific
7. Eletroforese e Western blotting< / forte >
monômero de acrilamida, N, N '- metilenobis-acrilamida	Bio-Rad	# 161-0125
Persulfato de amônio	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 papel de filtro	Fischer Scientific	# 09-806A
de transferência de gel iBlot
membranas de nitrocelulose	Bio-Rad	# 162-0115
Anticorpo monoclonal Anti-Flag M2	Sigma	#F3165
Peroxidase de rábano	Amersham	#NA931V
padrões de peso molecular de proteína	Bio-Rad	#161-0363
Reagente de quimioluminescência	PIERCE	#1856136
Filme de autorradiografia	Clonex Corp	#CLEC810
Papel absorvente Quick Draw	Sigma	#P7796
C2 agitador de balanço	da plataforma New Brunswick Scientific, EUA
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Inibidores de protease	Roche	#800-363-5887
0,5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9. Reagentes e equipamentos de purificação Affinity
0.8 x 4 cm Coluna de polipropileno Bio-Rad		732-6008
Nuclease de benzonase	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 grânulos de agarose	Sigma	#A2220
Grânulos de calmodulina-sepharose	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558<
Methanol	Bioshop	#MET302
Ácido acético	Bioshop	t#ACE222
Tiossulfato de sódio	Sigma	#S-7143
Nitrato de prata	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldeído	Bioshop	#FOR201
Carbonato	de sódioBioshop	#SOC512
11. Reagentes e equipamentos para identificação de proteínas
fortetripsina, grau de espectrometria de massa	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrila	Sigma	#A998-4
Fórmica ácido	Sigma	#F0507
HPLC grau de água	Sigma	# 95304
Iodoacetamida	Sigma	# 16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~ 10 cm de 3 μ m Resina Luna-C18	Phenomenex
Proxeon nano HPLC bomba	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos espectrômetro		Thermo Fisher Scientific
12. Material de laboratório
frascos cónicos de 4 litros	VWR	#89000-372
Tubos de polipropileno de 50 ml Tubos
de microcentrífuga de 1,5 ml	Qualquer fornecedor
Flaks cónicos de 250 ml	VWR	#29140-045
Tubos de cultura estéreis de 15 ml	Thermo Scientific	#366052
Frascos criogénicos	VWR	#479-3221-80
° C freezer	Fisher Scientific	#13-990-14
Sistema de vácuo de velocidade	Thermo Scientific
Buffers and Solutions 1. 1 litro Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g de Extrato de Levedura 2% Glicerol 50 ml de estoque de sal de potássio solução 2. Solução estoque de sal de potássio 1,5 M K2HPO4 0,35 M KH2PO4 3. Tampão de sonicação 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 10% de glicerol Antes de usar, adicione o inibidor de protease (PI) e 0,1-0,5 mM TCEP 4. Tampão AFC 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,1% detergente Antes de usar, adicione PI e 0,1-0,5 mM TCEP 5. Tampão de clivagem TEV 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 0,1% detergente Antes de usar, adicione PI e 0,1-0,5 mM TCEP 6. Tampão de ligação de calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1% detergente Antes de usar, adicione PI e 0,1-0,5 mM TCEP 7. Tampão de lavagem de calmodulina 30 mM Tris-HCl pH 7,9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1-0,5 mM TCEP 8. Tampão de eluição de calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0,1-0,5 mM TCEP 9. Solução reveladora (1L) 37% Formaldeído 30 g de carbonato de sódio 1000 ml de água destilada 10. Tampão de digestão 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Solução de umedecimento e equilíbrio 70% acetonitrila (ACN) em ácido fórmico a 0,1% 12. Solução de lavagem 100% H2O em ácido fórmico a 0,1%