Um método de transferência de genes em embriões de galinha em fases posteriores de incubação (com mais de Hamburger e Hamilton fase (HH) 22) é descrito. Este método supera as desvantagens dos In ovo aplicado aos embriões de galinha e mais velhos é uma técnica útil para estudar a função e regulação gênica em estádios mais avançados de desenvolvimento.
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Artigo de método
Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O embrião de galinha fornece um sistema modelo excelente para estudar a função e regulação de genes durante o desenvolvimento embrionário. Em electroporação in ovo é um método poderoso para sobre-expressar genes exógenos ou para baixo-regular os genes endógenos in vivo em embriões de galinha 1. Diferentes estruturas, tais como genes de DNA plasmídeos codificando 2-4, pequena interferência RNA (siRNA) plasmídeos 5, pequeno sintético RNA oligos 6, e os oligonucleótidos anti-sentido morfolino 7 pode ser facilmente transfectado em embriões de galinha por electroporação. No entanto, a aplicação de eletroporação em ovo é limitada aos embriões em estágios iniciais de incubação (menores de estágio HH20 - de acordo com Hamburgo e Hamilton) 8 e existem algumas desvantagens para a sua aplicação em embriões em estágios mais avançados (com mais de estágio HH22 - cerca de 3,5 dias de desenvolvimento). Por exemplo, a membrana vitelina em fases posteriores é usualiado preso à membrana devem e abrir uma janela no shell provoca ruptura dos vasos, resultando na morte dos embriões; embriões mais velhos são cobertos por vitelina e alantóide navios, onde é difícil de acessar e manipular os embriões; embriões mais velhos mover vigorosamente e é difícil de controlar a orientação através de uma janela relativamente pequena na concha.
Neste protocolo, demonstramos um método de eletroporação ex ovo de transferência de genes em embriões de galinha em estágios mais avançados (com mais de estágio HH22). Para eletroporação in ovo ex, os embriões são cultivadas em placas de Petri de 9 e vitelina e alantóide embarcações são amplamente difundidos. Sob estas condições, os embriões de galinha mais velhos são facilmente acessíveis e manipulado. Portanto, este método supera as desvantagens de ovo em electroporação aplicado aos embriões de galinha mais velhos. Usando este método, os plasmídeos podem ser facilmente transfectado em diferentes partesdos embriões de galinha mais velhos 10-12.
Protocolo
1. Cultura Ex ovo
- Frescas ovos fertilizados são colocados em seu lado mais longo em uma forçada projecto incubadora (BSS160, Ehret, Alemanha) a 37,5 ° C com umidade de 60% para a incubação. Ovos armazenados a 12 ° C durante mais de uma semana não deve ser utilizado.
- Após a incubação durante 2,5 dias (cerca de estágio HH17), retire os ovos e rotular o topo com um lápis para indicar a direção para quebrar.
- Antes de craqueamento, verter cerca de 20 ml de água destilada estéril para uma placa de Petri limpo grande (diâmetro de 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Alemanha).
- Coloque outra pequena placa de Petri estéril (diâmetro ....
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Discussão
Este protocolo fornece um guia para a transferência de genes em embriões de galinha mais velhos (por exemplo, para o tecto óptico em E6) por electroporação in ovo ex. Este método estende a utilização de electroporação de embriões de galinha mais velhos e pode ser facilmente aplicado a muitos laboratórios para estudar a função do gene in vivo em fases posteriores. Embriões de E4, a pelo menos E7 pode com sucesso ser electroporado por este método e os embriões eletroporados pode ser sobrevivência até E15.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma doação da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG; LU1455/1-1).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome | Companhia | Número de Catálogo | |
| Electroporator | Nepa Gene, Japão | CUY21-Edit | |
| Eletrodos | Nepa Gene, Japão | CUY661-3x7 | |
| Ovo incubadora | Ehret, Alemanha | BSS160 | |
| Embrião incubadora | BINDER GmbH, Alemanha | ||
| Microscópio fluorescente | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Placa de Petri | Greiner Bio-One GmbH, Alemanha | ||
| Extrator de microeletrodos | Mundo Precision Instruments, Alemanha | PUL-100 |
Referências
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C.
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Reimpressões e permissões
