Avaliação de replicação e função das células beta no Adenovirally transduzidas isoladas ilhotas de roedores

Summary

Este protocolo permite uma para identificar factores que modulam a massa de células funcional de beta para encontrar potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da diabetes. O protocolo é constituído por um método simplificado para avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhéus isolados de ratos após a manipulação da expressão do gene com adenovírus.

Abstract

Homeostase da glucose é principalmente controlada pela insulina hormonas endócrinas e glucagon, secretada a partir da beta pancreáticas e células alfa, respectivamente. Massa celular funcional beta é determinado pela massa anatómica beta celular, bem como a capacidade das células beta para responder a uma carga de nutriente. Uma perda de massa funcional das células beta é central para ambas as formas principais de diabetes ^1-3. Considerando que as declínio da capacidade funcional das células beta resultados de massa de um ataque auto-imune em pacientes com diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, este decréscimo se desenvolve tanto uma incapacidade das células beta a secretar insulina de forma apropriada e destruição das células beta de um quadro de mecanismos. Assim, os esforços para restabelecer a massa de células beta funcional são fundamentais para o melhor tratamento e possíveis curas para o diabetes.

Esforços estão em andamento para identificar caminhos moleculares que podem ser exploradas para estimular a replicação e melhorar a função das células beta.Idealmente, alvos terapêuticos iria melhorar tanto o crescimento das células beta e função. Talvez o mais importante é que para identificar se uma estratégia que estimula o crescimento das células beta está no custo da função das células beta prejudicando (tal como com alguns oncogenes) e vice-versa.

Sistematicamente suprimindo ou superexpressão de expressão de genes-alvo em ilhéus isolados de ratos, é possível identificar potenciais alvos terapêuticos para o aumento da massa funcional das células beta ^4-6. Vectores adenovirais podem ser empregues para proteínas eficientemente superexpressam ou knockdown em ilhéus isolados de ratos ^4,7-15. Aqui, nós apresentamos um método para manipular a expressão do gene utilizando transdução adenoviral e avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhéus isolados de ratos (Figura 1). Este método tem sido utilizado anteriormente para identificar novos alvos que modulam a replicação das células beta ou função ^{5,6,8,9,16,17.}

Protocol

1. Transdução adenoviral e cultura de ilhotas de ratos

1. Prepara-se uma placa de 6 poços de cultura de tecido não-revestido por adição de 2 ml de meio (RPMI 1640 contendo 8 mM de glucose, 10% de soro fetal bovino, 50 unidades / ml de penicilina, e 50 ug / ml de estreptomicina) para o número necessário de poços. Por exemplo, uma experiência típica pode exigir três poços - um para cada um controlo não-vírus, um controle de vírus (por exemplo, GFP-expressando adenovírus), eo grupo experimental.
2. Aqueceu-se a placa a 37 ° C, colocando-a em uma cultura de tecidos incubadora durante pelo menos 30 min.
3. Imediatamente após o isolamento de rato ilho....

Discussion

Vias, que estabelece que pode ser modulada para estimular a replicação e melhorar a função das células beta são relevantes para ambas as formas principais de diabetes. Devido massa celular funcional beta é dependente da existência e função de células secretoras de insulina, avaliando estes determinantes simultaneamente tem as suas vantagens. Este protocolo descreve um protocolo simplificado para identificar se a superexpressão ou supressão de uma proteína leva a alterações na massa funcional das células beta in vitr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640 meios	Gibco	11879
A penicilina / estreptomicina	Gibco	15140
6-bem placa	BD-Falcon	35-1146	Non-TC tratada
[Metil-3 H]-timidina	Perkin Elmer	NET027Z001MC	1 mCi / ml
Micro-centrífuga tubos	Denville	C2170	1,7 ml
NaCl	Sigma	59888
KCl	Acros	42409
KH 2 </ Sub> PO 4	Acros	20592
MgSO4	Acros	41348
CaCl 2	Acros	34961
HEPES	Sigma	H0887	Solução 1 M
35% de BSA	Sigma	A7979
De NaHCO3	Acros	42427
d-glicose	Sigma	G8769
TCA	Fisher Scientific	SA9410-1	10% w / v
NaOH	Acros	12426
Contagem de cintilação tubo	Sarstedt	58,536	7 ml, PP
Cintilação tampa do tubo de contagem	Sarstedt	65,816
Econo-Safe cocktail contando	RPI	111175
RIA Insulina	Siemens	TKIN2
BCA Assay Kit	Thermo Scientific	23250
			Equipamento
Centrifugar	Eppendorf	5415R
Contagem de cintilação suporte de tubos	Sarstedt	93.1431.001
Contador de cintilação líquida	Perkin Elmer	Tri-Carb 2910TR