Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na C. elegans

Resumo

Este artigo detalha como usar contínuo fluxo de câmaras de hipóxia para gerar atmosferas com concentrações definidas de O ₂ Para entender as respostas biológicas à diminuição da O ₂. Este sistema é fácil de configurar e manter, e flexível o suficiente para atender uma ampla gama de O ₂ Concentrações e sistemas modelo

Resumo

O oxigênio é essencial para todos os metazoários para sobreviver, com uma exceção conhecida ^1. Diminuição da disponibilidade de O ₂ (hipóxia) podem surgir durante estados de desenvolvimento da doença, normal ou mudanças nas condições ambientais ^2-5. Compreender as vias de sinalização celular que estão envolvidos na resposta à hipóxia poderia fornecer uma nova visão sobre estratégias de tratamento para diversas patologias humanas, por acidente vascular cerebral ao câncer. Este objectivo tem sido impedida, pelo menos em parte, por dificuldades técnicas associadas com a exposição hipóxico controlada em organismos modelo geneticamente passíveis.

Os Caenorhabditis elegans nematóide é idealmente adequada como organismo modelo para o estudo da resposta hipóxica, como é fácil de cultura e manipular geneticamente. Além disso, é possível estudar a resposta celular a específicos hipóxicas O ₂ concentrações sem efeitos de confusão desde C. elegans obter O ₂ (e outros gases) por difusão, em oposição a um sistema respiratório facilitada ^6. Factores conhecidos para ser envolvido na resposta à hipoxia são conservados em C. elegans. A resposta à hipoxia real depende da concentração específica de O ₂ que está disponível. Em C. elegans, a exposição a moderada hipóxia elicia uma resposta de transcrição mediada em grande parte por hif-1, os altamente conservadas hipóxia induzível-factor de transcrição ^6-9. C embriões. elegans requerem hif-1 para sobreviver em 5,000-20,000 ppm O ₂ ^7,10 . A hipóxia é um termo geral para "menos de O normal _2". Normóxia (normal O ₂₎ pode também ser difícil de definir. Nós geralmente consideram ar ambiente, que é 210.000 ppm O ₂ estar normóxia. No entanto, tem sido mostrado que a C. elegans tem uma preferência comportamental para O ₂ concentrações de 5-12% (50,000-120,000 ppm O ₂₎ ^11. Em larvae e adultos, HIF-1 atua para evitar hipóxia induzida por diapausa em 5.000 ppm O ₂ ^12. No entanto, hif-1 não desempenha um papel na resposta a concentrações mais baixas de O ₂ (anoxia, definição operacional <10 ppm O ₂₎ ^13. Em anoxia, C. elegans entra em um estado reversível de animação suspensa em que toda a atividade microscopicamente observável deixa ^10. O fato de que diferentes respostas fisiológicas ocorrem em diferentes condições ressalta a importância de ter o controle experimental sobre a concentração hipóxica de O _2.

Aqui, apresentamos um método para a construção e implementação de câmaras ambientais que produzem confiáveis ​​e reprodutíveis condições de hipóxia, com concentrações definidas de O _2. O método de fluxo contínuo assegura equilíbrio rápido da câmara, e aumenta a estabilidade do sistema. Além disso, a transparência eaacessibilidade das câmaras permitem a visualização direta de animais expostos à hipóxia. Nós ainda demonstrar um método eficaz de colheita C. elegans amostras rapidamente após a exposição à hipoxia, o que é necessário observar que muitas das alterações rapidamente-invertidas que ocorrem em ^10,14 hipóxia. Este método proporciona uma fundação de base que pode ser facilmente modificado para as necessidades individuais de cada laboratório, incluindo sistemas de modelos diferentes e uma variedade de gases.

Protocolo

1. Construção das Câmaras Ambientais

1. Selecione o menor volume razoável de câmara necessário para o alcance de seu projeto. Câmara deve ser feita de gás (O ₂₎ de material impermeável. Pratos Pyrex de cristalização, caixas Anaeropack, ou grandes fundido acrílicos-caixas (Ellard Instrumentation), podem ser usados. Descobrimos que 50 placas de 9 mm, podem caber em um prato 100 x 50 KIMEX cristalização. Placas de vidro pode ser usado como tampas para pratos de cristalização Pyrex.
2. Perfurar um furo na câmara seleccionado e se encaixam com um macho de plástico Luer para encaixe da mangueira farpa (Cole Parmer). Acessórios podem ser asseguradas por encaixe de tubulação ou com epóxi. Instalar um acessório semelhante no lado oposto do recipiente para permitir que o gás flua para dentro e para fora da câmara. Se possível, compensar furos para aumentar a mistura turbulenta.
3. Obter os tanques de gás comprimido com definidas O ₂ concentrações (equilibrada com N ₂₎ que são certificados padrão para ó co ₂ntent ou, para as condições anóxicas, puro N ₂ (<10 ppm O _2). Use-automáticas mudar mais de reguladores para estudos de longo prazo para evitar perturbar os níveis de oxigênio nas câmaras.
4. Resposta à hipoxia organismal foi mostrado para ser temperatura ¹⁵ dependente. Ao colocar a câmara numa incubadora, a diferentes temperaturas pode ser mantida. Temperaturas dentro de uma incubadora pode ser irregular e, como tal, é prudente fazer uso de um registador de dados de temperatura para medir constantemente a temperatura no interior da câmara.

2. Ligar o gás para a Câmara Ambiental

1. Para todas as conexões, use um oitavo de polegada de diâmetro exterior tubo conectado por meio de conectores o snap ou acessórios de compressão. Tubos devem ser impermeável e não reactivo com O _2, tais como etileno propileno fluorado (FEP) ou nylon (Cole Parmer). Para um diagrama esquemático da instalação completa, ver Figura 1.
2. Conecte o comprensados ​​tanques de gás para um dispositivo de controlo de fluxo, tais como um controlador de fluxo de massa (Sierra Instruments) ou rotâmetro (Aalborg). Assegurar que a pressão a montante do tanque está dentro do alcance do dispositivo de fluxo e as mangueiras farpa. Dois estágios reguladores são geralmente usadas, com a segunda etapa definida como a pressão desejada [Veja a seção três para selecionar a taxa de fluxo adequado]
3. O gás hidrato por borbulhamento através de água destilada utilizando uma garrafa de lavagem de gás com o cilindro poroso, em seguida, directa em um dos acessórios na câmara ambiental, deixando o encaixe segundo aberto para gases de escape (ver Figura 1). Para estudos de curto prazo, a hidratação de gás protege contra dessecação placa, mas a monitorização de humidade pode ser necessário para estudos de longo prazo.
4. Dow Corning graxa vácuo pode ser utilizado para vedar a câmara. Pesos de lugar sobre a tampa da câmara de assegurar uma vedação hermética. Para confirmar uma vedação firme e fluxo adequado, mantenha uma pequena piscina de água na palma da ynossa mão enluvada para o apetrechamento da câmara e verifique se há bolhas.

3. Seleção de Vazão

1. Assumindo perfeita mistura, existe a troca gasosa de 90% da atmosfera gasosa cada vez que o volume da câmara é substituído (Lei de Fick). Por exemplo, em uma câmara de cc 100 com um caudal de 100 cc / min, o ar casa original na câmara de irá ser substituído com 90% do seu gás desejado depois de 1 minuto, e vai assintoticamente aproximar troca completa em 90% a cada minuto depois disso.
2. Maiores taxas de fluxo e recipientes menores vai chegar a sua concentração de oxigênio desejado mais rapidamente. Para 100 x 50 KIMEX recipientes (400 cc), uma taxa de fluxo de 120 cc / min atingirá troca 99,9% em 10 minutos (3 trocas). Esta taxa de fluxo é adequado para a maioria das condições de oxigénio. Para o nosso conhecimento, não houve uma investigação sistemática de como a taxa de variação da concentração de O ₂ influencia a resposta em C. elegans.

1. Worms expostas a condições hipóxicas comumente escapar a superfície de placas de agar. Para evitar isso, colocar um anel de ácido palmítico (10 mg / ml em etanol) em torno da borda das placas. O ácido palmítico irá sair da solução como se evapora etanol, formando uma barreira física. Barreiras de ácido palmítico não afetar a taxa de postura de ovos, a fecundidade ou longevidade em C. elegans ^16,17. Buraqueira não ocorre mais freqüentemente em condições de hipóxia, de modo adicionais medidas preventivas não são geralmente necessários.
2. 1. Gerar populações sincronizadas pelo branqueamento adultos grávidas em uma pequena gota de solução de lixívia alcalina em unseeded nematóides de crescimento da mídia (NGM) placas ^18. Em contraste com protocolos padrão de lote-grande de hipoclorito de branqueamento, escolher 1-100 animais em uma gota de solução de lixívia na superfície de uma placa NGM, então permitir que a solução de lixívia para absorver na placa
   2. Evite expor embriões clareados à hipóxia, pois isso pode reduzir a viabilidade ^13. Para recolher os embriões jovens (2-4 células), adultos fêmeas grávidas pode ser cortado em um pequeno volume de água com uma lâmina de barbear e embriões movido para placas por pipeta boca por exposição subsequente à hipoxia.
3. Selar placas na câmara ambiental. Os animais de controlo deve ser mantido em normóxia (casa de ar), à mesma temperatura como vermes tratados. Não existe nenhuma diferença entre as amostras deixadas observável na casa de ar e as mantidas em uma câmara idêntica com casa de ar que flui sobre eles. Iniciar o fluxo de gás e manter uma exposição durante o tempo desejado. Para assegurar a uniformidade na rampa, certifique-se desubstituir a água no frasco de lavagem de gás antes da exposição.
4. Para a sobrevivência de embriões de ensaio, permitem que os vermes para desenvolver durante 48 h após o retorno ao ar ambiente, altura em que eles devem ser quarta fase larvas / dia um adultos. Pontuação para a sobrevivência, a censura quaisquer vermes que não podem ser contabilizados.
5. Para visualizar os animais expostos à hipoxia, mover vermes para uma gota de M9 sobre uma lamela 22 mm ^2, e inverter para uma almofada de agarose a 2% em M9 ^18. Se o levamisole, necessário (25 mM) ou azida de sódio (10 mM) pode ser usado como anestésico. A azida de sódio e levamisole podem confundir algumas observações devido à toxicidade e deve ser judiciosamente usado ^19.

5. Colheita rápida de hipoxemia expostas Worms (Exemplo: preparação de amostras para HIF-1 Análise ocidental)

Muitos induzida por hipóxia efeitos são rapidamente revertidos após o retorno ao ar ambiente, incluindo a retomada de produção de ovos, ^{12 de} fosforilação de epítopos de mitosena embriogénese ¹³ e degradação da proteína HIF-1 ^9,20. Isolamento rápido de animais expostos à hipoxia é necessária para se obter efeitos reprodutíveis nestas condições. Com esta configuração, os animais podem ser colhidos e congelados em azoto líquido em menos de dois minutos. Enquanto câmaras de hipóxia Porta-luvas para permitir a manipulação de amostras em condições anóxicas, o seu custo e praticidade para outras condições de anoxia limitar a sua utilidade.

1. Crescer Bristol N2 vermes em 4 10 cm crescimento elevado (HG) placas até que a maioria dos vermes são adultos fêmeas grávidas ^18. Lavar vermes para um tubo cónico de 15 mL contendo uma solução 01:05 de lixívia alcalina e incubar com rotação, até que os vermes começam a dissolver-se, não mais de 5 minutos ^9. Lave os vermes três vezes com M9, girando para baixo a 1500 xg entre cada lavagem sem frenagem.
2. Embriões placa branqueada para 8 150 placas NGM mm e permitam desenvolver a L4 larvas (~ 48 horas para Bristol N2 a 22 ° C).Mover as placas para as câmaras ambientais e expor a hipóxica (1000 ppm, 5000 ppm) e (N2) anóxicas condições durante 4 horas. Os tempos de exposição variam de acordo com desenho experimental. Embora a exposição à hipoxia tem um efeito imediato sobre a taxa de postura de ovos, dois embriões de células morrem após 16-18 horas de exposição ^12. Com esta configuração câmara de hipoxia, o limite inferior de exposição é limitada pela taxa de câmbio atmosfera necessária para atingir o equilíbrio.
3. Rótulo um tubo de microcentrífuga 1,5 mL e um tubo de 15 mL cónica para cada amostra experimental. Worms expostos à hipoxia são mais propensos a aderir aos lados do tubo, durante a colheita. Para evitar isto, o local de 100 uL de sulfato de sódio a 1% de dodecil (SDS) em cada tubo 15 mL cónico. Se SDS inibe aplicações a jusante, albumina de soro bovino (BSA) pode ser usado para evitar a aderência. O uso rotineiro de SDS ou BSA não parecem ter uma diferença aparente. Adicionar 50 ul de proteína 2x carregamento corante (4% de SDS, 10% 2-mercaptoetanol e umUm traço de azul de bromofenol em glicerol 30% (w / v)) para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tenha um Dewar de nitrogênio líquido pronto.
4. Horário das etapas após remover os vermes de hipóxia e registro. Remover a tampa para a câmara de hipóxico, tomar uma placa de amostra, e feche a câmara. Use água destilada para lavar os vermes para um filtro de nylon e, em seguida, derramar para dentro do tubo 15 mL cónico. Gire os vermes para baixo em uma centrífuga de mesa a 1500 xg durante 15-20 segundos com freio.
5. Use um vácuo para remover a maior parte do sobrenadante do tubo, deixando o verme pelete intacto.
6. Usando uma pipeta, mover o verme pellet em 50 uL para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Selar o tubo e imerso em nitrogênio líquido.
7. Repita até que todas as amostras terem sido isolado. Siga estes procedimentos para casa amostras de controle de ar para a consistência. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C.

6. Os resultados representativos

Efeitos organismal de hipóxia pode ser vistoexaminando a viabilidade para a vida adulta de C. elegans (Figura 2). Embriões estabelecidas por tipo selvagem Bristol (N2) e hif-1 (ia04) mutantes de deleção são todos sobrevivem em casa com ar de O ₂ concentrações (210.000 ppm O _2). N ₂ vermes são capazes de se adaptar e sobreviver até a idade adulta em 5.000 ppm O _2, enquanto HIF-1 embriões não são viáveis. Isto mostra que HIF-1 é essencial para a adaptação a alteração dos níveis de oxigénio disponível no ambiente de ^10. Nem N2 nem HIF-1 animais podem sobreviver a exposição a 1000 ppm O _2.

A visualização verme directamente em hipoxia é viável com a utilização de um âmbito de dissecação e recipiente transparente (Figura 3). Por directamente colocando a câmara de hipóxia sobre o âmbito de dissecação, não há necessidade de remover os vermes de hipóxia para observar as reacções dos organismos. O âmbito pode ser equipado com illumation fluorescência (como na Figura 3

Figura 1. Exemplo de direcção da câmara. Hipoxia do fluxo de gás é indicado por setas. O gás é armazenado em tanques de gás comprimido com definidas O ₂ concentrações (1) e um regulador de dois estágios está ligado (2). Gás entra no fundo do tubo de fluxo (3), que sai do topo, à taxa de fluxo correcta. Gás flui então para o balão de bolha (4), hidratar o gás (garantir a ligação correcta do balão bolha observando bolhas). Gás hidratado em seguida, passa para a câmara de hipóxia na válvula de entrada (5), expondo as amostras a hipoxia. O gás finalmente aberturas para dentro da sala através de um orifício de escape perfurados na câmara.

Figura 2. Viabilidade de embriões expostos a 1.000 ppm O _2, 5.000 ppm S _2). Os embriões foram expostas a cada condições de oxigénio como embriões por 24 horas em câmaras de oxigénio de fluxo contínuo. Worms foram transferidas para condições normóxicas, deixou-se desenvolver até à idade adulta, durante 48 horas, e depois marcou para a viabilidade até à idade adulta. n> 50, N = 5.

Figura 3. Visualização de C. elegans em hipóxia com microscopia. Worms estão expostos a hipóxia usando os métodos descritos. A câmara transparente ambiental (construído com um prato de cristalização pirex e placa de vidro) é colocado diretamente no palco de um escopo de dissecação. Dois pontos de vista são apresentados, incluindo um fluxo de gás de todo o conjunto para cima, o outro apenas com a câmara no palco microscópio.

Discussão

Este método apresenta uma estratégia para a construção de um ambiente hipóxico que permite a ambientes com concentrações precisas de oxigénio possa ser mantida no laboratório. Estas câmaras fornecer um método simples para expor os organismos específicos para baixas concentrações de O ₂ e monitorização das saídas moleculares e fisiológicas. A câmara ambiental descrito é montado pelo laboratório, em vez de adquirida comercialmente e podem assim ser alterado para se adequar às necessidades da experiência.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Tubulação (FEP e PTFE)	Cole Parmer Tygon	YO-95821-00 (1/8 "FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8 "PTFE) 'R-3603
Acessórios de compressão	Sistemas de Seattle dos Fluidos	06363-58 (M. acoplador 1/16 ") 06363-62 (F. acoplador 1/16 ") 06363-60 (M. acoplador 1/8 ") 06363-61 (F. acoplador 1/8 ")
Tubo de fluxo	Aalborg	PMR3-010073 (3 saídas) PMR1-013520 (1 saída)
Controlador de fluxo de massa	Sierra Instruments	810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Trak inteligente 2)
Tanque de gás comprimido	Airgas	Feito à ordem
Plástico Luer macho para acessórios espigão	Cole Parmer	45505-41 (série 500 1/16 ")
Elenco caixas de acrílico	Ellard Instrumentação	Feito sob encomenda
Acessórios para tubos (latão ou aço inoxidável)	Sistemas de Seattle dos Fluidos	B-402-1 (1/4 porca ") B-200-3 (1/8 "tee união) B-400-set (1/4 de virolas) B-QM2 B1-200 (QM QC Body) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 "conn macho)
Dow Corning graxa para vácuo	Sigma-Aldrich	Z273554
Caixa AnaeroPack	Misubishi Gas Chemical Company	R684004 (0,4 litro) R685025 (2,5 litro) R685070 (7,0 litro)
Pyrex frasco de lavagem de gás	Sigma-Aldrich	CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL)
O ácido palmítico	Sigma-Aldrich	P0500
Cabra anti-ratinho de peroxidase de rábano-IgG	Southern Biotechnology Associates	1032-1005
SuperSignal Oeste Substrato Chemiluminsecent Pico	Pierce Chemical	34077
100 x 50 pratos de vidro de cristalização	Kimax Kimble	23000