Este artigo detalha como usar contínuo fluxo de câmaras de hipóxia para gerar atmosferas com concentrações definidas de O 2 Para entender as respostas biológicas à diminuição da O 2. Este sistema é fácil de configurar e manter, e flexível o suficiente para atender uma ampla gama de O 2 Concentrações e sistemas modelo
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Artigo de método
Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na
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Resumo
Resumo
O oxigênio é essencial para todos os metazoários para sobreviver, com uma exceção conhecida 1. Diminuição da disponibilidade de O 2 (hipóxia) podem surgir durante estados de desenvolvimento da doença, normal ou mudanças nas condições ambientais 2-5. Compreender as vias de sinalização celular que estão envolvidos na resposta à hipóxia poderia fornecer uma nova visão sobre estratégias de tratamento para diversas patologias humanas, por acidente vascular cerebral ao câncer. Este objectivo tem sido impedida, pelo menos em parte, por dificuldades técnicas associadas com a exposição hipóxico controlada em organismos modelo geneticamente passíveis.
Os Caenorhabditis elegans nematóide é idealmente adequada como organismo modelo para o estudo da resposta hipóxica, como é fácil de cultura e manipular geneticamente. Além disso, é possível estudar a resposta celular a específicos hipóxicas O 2 concentrações sem efeitos de confusão desde C. elegans obter O 2 (e outros gases) por difusão, em oposição a um sistema respiratório facilitada 6. Factores conhecidos para ser envolvido na resposta à hipoxia são conservados em C. elegans. A resposta à hipoxia real depende da concentração específica de O 2 que está disponível. Em C. elegans, a exposição a moderada hipóxia elicia uma resposta de transcrição mediada em grande parte por hif-1, os altamente conservadas hipóxia induzível-factor de transcrição 6-9. C embriões. elegans requerem hif-1 para sobreviver em 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . A hipóxia é um termo geral para "menos de O normal 2". Normóxia (normal O 2) pode também ser difícil de definir. Nós geralmente consideram ar ambiente, que é 210.000 ppm O 2 estar normóxia. No entanto, tem sido mostrado que a C. elegans tem uma preferência comportamental para O 2 concentrações de 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. Em larvae e adultos, HIF-1 atua para evitar hipóxia induzida por diapausa em 5.000 ppm O 2 12. No entanto, hif-1 não desempenha um papel na resposta a concentrações mais baixas de O 2 (anoxia, definição operacional <10 ppm O 2) 13. Em anoxia, C. elegans entra em um estado reversível de animação suspensa em que toda a atividade microscopicamente observável deixa 10. O fato de que diferentes respostas fisiológicas ocorrem em diferentes condições ressalta a importância de ter o controle experimental sobre a concentração hipóxica de O 2.
Aqui, apresentamos um método para a construção e implementação de câmaras ambientais que produzem confiáveis e reprodutíveis condições de hipóxia, com concentrações definidas de O 2. O método de fluxo contínuo assegura equilíbrio rápido da câmara, e aumenta a estabilidade do sistema. Além disso, a transparência eaacessibilidade das câmaras permitem a visualização direta de animais expostos à hipóxia. Nós ainda demonstrar um método eficaz de colheita C. elegans amostras rapidamente após a exposição à hipoxia, o que é necessário observar que muitas das alterações rapidamente-invertidas que ocorrem em 10,14 hipóxia. Este método proporciona uma fundação de base que pode ser facilmente modificado para as necessidades individuais de cada laboratório, incluindo sistemas de modelos diferentes e uma variedade de gases.
Protocolo
1. Construção das Câmaras Ambientais
- Selecione o menor volume razoável de câmara necessário para o alcance de seu projeto. Câmara deve ser feita de gás (O 2) de material impermeável. Pratos Pyrex de cristalização, caixas Anaeropack, ou grandes fundido acrílicos-caixas (Ellard Instrumentation), podem ser usados. Descobrimos que 50 placas de 9 mm, podem caber em um prato 100 x 50 KIMEX cristalização. Placas de vidro pode ser usado como tampas para pratos de cristalização Pyrex.
- Perfurar um furo na câmara seleccionado e se encaixam com um macho de plástico Luer para encaixe da mangueira farpa (Cole Parmer). Acessórios podem ser assegurada....
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Discussão
Este método apresenta uma estratégia para a construção de um ambiente hipóxico que permite a ambientes com concentrações precisas de oxigénio possa ser mantida no laboratório. Estas câmaras fornecer um método simples para expor os organismos específicos para baixas concentrações de O 2 e monitorização das saídas moleculares e fisiológicas. A câmara ambiental descrito é montado pelo laboratório, em vez de adquirida comercialmente e podem assim ser alterado para se adequar às necessidades da experiência.
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos os membros do laboratório de Miller para a discussão e leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de novo investigador do Centro de Choque Nathan de Excelência em Biologia Básica do Envelhecimento a DLM e pelo National Institutes of Health prêmio R00 AG030550 a DLM.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Tubulação (FEP e PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8 "FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8 "PTFE) 'R-3603 | |
| Acessórios de compressão | Sistemas de Seattle dos Fluidos | 06363-58 (M. acoplador 1/16 ") 06363-62 (F. acoplador 1/16 ") 06363-60 (M. acoplador 1/8 ") 06363-61 (F. acoplador 1/8 ") | |
| Tubo de fluxo | Aalborg | PMR3-010073 (3 saídas) PMR1-013520 (1 saída) | |
| Controlador de fluxo de massa | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Trak inteligente 2) | |
| Tanque de gás comprimido | Airgas | Feito à ordem | |
| Plástico Luer macho para acessórios espigão | Cole Parmer | 45505-41 (série 500 1/16 ") | |
| Elenco caixas de acrílico | Ellard Instrumentação | Feito sob encomenda | |
| Acessórios para tubos (latão ou aço inoxidável) | Sistemas de Seattle dos Fluidos | B-402-1 (1/4 porca ") B-200-3 (1/8 "tee união) B-400-set (1/4 de virolas) B-QM2 B1-200 (QM QC Body) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 "conn macho) | |
| Dow Corning graxa para vácuo | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| Caixa AnaeroPack | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0,4 litro) R685025 (2,5 litro) R685070 (7,0 litro) | |
| Pyrex frasco de lavagem de gás | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) | |
| O ácido palmítico | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Cabra anti-ratinho de peroxidase de rábano-IgG | Southern Biotechnology Associates | 1032-1005 | |
| SuperSignal Oeste Substrato Chemiluminsecent Pico | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 pratos de vidro de cristalização | Kimax Kimble | 23000 |
Referências
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30(2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Ce....
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Reimpressões e permissões
