Artigo de método

C. elegans Acompanhamento e Medição do Comportamento

DOI:

10.3791/4094

⸱

17 de novembro de 2012

 ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit, 3Okinawa Institute of Science and Technology, 4Department of Physics, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temos desenvolvido um vídeo taxa de sistema de microscópio de rastreamento que pode gravar e quantificar C. elegans Comportamento de alta resolução e de alta velocidade. Também desenvolvemos métodos computacionais para reduzir a dimensionalidade das imagens sem-fim de um conjunto básico de medições que descrevem completamente a forma do sem-fim.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós desenvolvemos técnicas de análise de instrumentação, processamento de imagem e os dados para quantificar o comportamento locomotor de C. elegans, uma vez que rastreia na superfície de uma placa de agar. Para o estudo da base genética, bioquímica, e neuronal de comportamento, C. elegans é um organismo ideal porque é geneticamente tratável, passível de microscopia, e mostra uma série de comportamentos complexos, incluindo táxis, aprendizagem, e 1,2 interação social. Análise comportamental, baseada em acompanhar os movimentos de vermes como eles rastejar sobre placas de agar foram particularmente úteis no estudo do comportamento sensorial 3, 4 locomoção, e fenotipagem geral mutacional 5. O nosso sistema funciona movendo o sistema de câmara de iluminação e como os vermes se arrasta em uma placa de agar estacionário, o que assegura que não haverá estímulo mecânico é transmitido para o sem-fim. O nosso sistema de rastreio é fácil de utilizar e inclui uma característica de calibração semi-automático. Um challenge de todos os sistemas de seguimento de vídeo é que gera uma quantidade enorme de dados que é intrinsecamente elevado dimensional. Nossa programas de processamento de imagem e análise de dados lidar com este desafio, reduzindo a forma vermes em um conjunto de componentes independentes, os quais de forma abrangente reconstruir o comportamento vermes como uma função de apenas 3-4 dimensões 6,7. Como um exemplo do processo mostra-se que o vírus entra e sai do seu estado de inversão de fase de uma forma específica.

Protocolo

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1. Descrição do Microscópio de Seguimento

  1. Uma placa de ágar é iluminado por uma fonte de luz de fibra e fotografada com uma câmara. Este sistema é montado em um estágio de translação X, Y.
  2. A fase é movida por motores de passo padrão, os quais são ligados a um controlador de motor de passo.
  3. O controlador e da câmara são ligados ao computador e controlados por programas personalizados escritos em LabVIEW.
  4. A câmara capta as imagens da superfície de uma placa de ágar e identifica objetos escuros em um fundo claro.
  5. A qualidade de imagem é ajustado de modo que o programa de computador pode quantificar objectos em tempo real. O ganho, o brilho, e a velocidade do obturador da câmara pode ser ajustado para proporcionar um objecto escuro sobre um fundo branco.
  6. A marca de referência para o processo de calibração automática é feita por picar a superfície do agar com uma picareta verme.
  7. A imagem, filtrada binário que é usado pelo programa de controle pode ser verificado.
  8. O modoftware tem um recurso de auto-calibração que calcula a matriz de calibração movendo um objeto de teste a uma distância fixa.
  9. Distâncias em pixels é calibrado para medidas tomadas pelo motor de passo pela matriz de calibração.
  10. Após a calibração, o sistema está pronto para ir e não precisa ser recalibrado, a menos que a ampliação é alterada ou se a câmera é reposicionado.

2. Preparando Placas de Rastreamento e C. elegans para Rastreamento

  1. Um anel de cobre é utilizado para encurralar os vermes e mantê-los de migrar para a borda do prato. O cobre proporciona uma barreira química local e não afecta o movimento do sem-fim de outro modo para a duração da experiência (<1 hora). Aqueça o primeiro anel, colocando-o sobre uma placa de aquecimento ou equivalente.
  2. Anel lugar sobre uma placa de agar fresca (1,7% Agar Bacto, 0,25% de Bacto-peptona, 0,3% de NaCl, 1 mM de CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM de tampão de fosfato de potássio, 5 ug / mlcolesterol) e pressione um pouco para incorporá-lo na superfície do ágar.
  3. Escolha L4 fase ou vermes adultos jovens numa placa de ágar preenchido com algum buffer NGM (0,3% de NaCl, 1 mM de CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM de tampão de fosfato de potássio), para lavá-los de resíduos de comida. Deixe os vermes nadar por alguns minutos.
  4. Cuidadosamente coloque um único sem-fim na placa de controle, perto do centro do anel. E em seguida, coloque a placa sobre o rastreador worm.

3. Rastreamento Worm

  1. Execute o programa LabVIEW e selecionar as opções, se necessário (localização de imagens, tipos de imagens, medições, as configurações da câmera).
  2. Usando o joystick mover o microscópio até que uma imagem do verme está no campo de visão (ecrã de computador). Pressione "faixa" para envolver o programa de rastreamento.
  3. O programa de computador, na verdade, mede o movimento de uma imagens binárias filtradas conforme mostrado e pode fazer medições nesta imagem em tempo real
  4. À réer rastrear uma reconstrução da trajectória global pode ser feito a partir dos movimentos de motores de passo, enquanto a forma muda locais do sem-fim pode ser vista em detalhe.

4. Análise de Dados

  1. Executar script skeletonizing (MATLAB) para parametrizar formas do verme. (Figura 2)
  2. Calcule autovetores dos dados esqueletizadas. (Figura 3.4)
  3. Figura 5 mostram. Leia legenda da figura ou resultados representativos.

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Resultados

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Exemplo: Quando forrageamento, C. transições elegans de frente para reverter o movimento, muitas vezes realizando uma reorientação (ômega vez) antes de retornar ao estado de movimento para a frente. Quantificar essa transição é importante para entender os padrões de forrageamento de movimento e também no controle do worm motor. O poder de revelar detalhes sutis de comportamento locomoção pode ser visto através do nosso dispositivo rastreador.

Como exemplo, vamos olhar para ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estudo da locomoção e comportamento natural requer técnicas não-invasivas de rastreamento em parceria com técnicas de redução de dados. Aqui demonstramos um fácil de usar sistema de rastreamento que registra imagens detalhadas de C. elegans comportamento, uma vez que se arrasta na superfície de uma placa de agar. A quantidade de informação contida nestas imagens é vasto e de alta-dimensional, e por isso também têm desenvolvido métodos para reduzir a dimensionalidade dos dados em apenas quatro medidas fundamen...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome da peça Companhia Número de catálogo Comentários (opcional)
Câmera CCD Basler A601f
Lente Edmund Optics MMS série
Iluminação de fibra Dolan Jenner DC-950H
Estágio de tradução Deltron LS3-4
Stepper Motor EUA digitais MS23C
Motor de passo de unidade Lagartixa G201
Stepper controle motor SimpleStep SSXYZ
Todo o código de programação está disponível. Por favor, envie um e-mail pedido para o autor correspondente.

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
  2. de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
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