Alta taxa de transferência de célula única e múltipla de células Micro-encapsulamento

Summary

Combinando monodispersos geração gota com ordenação de inércia de células e partículas, nós descrevemos um método para encapsular um número desejado de células ou partículas em uma única gota a taxas kHz. Nós demonstramos a eficiência duas vezes superiores às de encapsulamento desordenada para gotas simples e dupla-partícula.

Abstract

Os métodos de encapsulamento microfluídico foram utilizados anteriormente para capturar células em gotas aquosas e monodispersas em escala de picolitros, proporcionando confinamento de um ambiente de fluido a granel com aplicações em triagem de alto rendimento, citometria e espectrometria de massa. Descrevemos um método não apenas para encapsular células únicas, mas para capturar repetidamente um número definido de células (aqui demonstramos o encapsulamento de uma e duas células) para estudar o isolamento e as interações entre as células em grupos de tamanhos controlados. Ao combinar técnicas de geração de gotas com ordenação de células e partículas, demonstramos o encapsulamento controlado de partículas do tamanho de células para encapsulamento eficiente e contínuo. Usando uma suspensão aquosa de partículas e óleo de fluorocarbono imiscível, geramos gotas aquosas de óleo com um bico de foco de fluxo. A taxa de fluxo aquoso é suficientemente alta para criar ordenação de partículas que atingem o bico em frequências múltiplas inteiras da frequência de geração de gotas, encapsulando um número controlado de células em cada gota. Para resultados representativos, partículas de poliestireno de 9,9 μm são usadas como substitutos celulares. Este estudo mostra uma eficiência de encapsulamento de partícula única P_{k = 1} de 83,7% e uma eficiência de encapsulamento de partícula dupla P_{k = 2} de 79,5% em comparação com suas respectivas eficiências de Poisson de 39,3% e 33,3%, respectivamente. O efeito da concentração consistente de células e partículas é demonstrado como de grande importância para o encapsulamento eficiente, e as transições de gotejamento para jateamento também são abordadas.

Introdução

As suspensões de células aquosas de meios contínuos compartilham um ambiente fluido comum que permite que as células interajam em paralelo e também homogeneíza os efeitos de células específicas nas medições do meio. O encapsulamento de alto rendimento de células em gotas em escala de picolitro confina as amostras para proteger as gotas da contaminação cruzada, permite uma medida da diversidade celular dentro das amostras, evita a diluição de reagentes e biomarcadores expressos e amplifica os sinais dos produtos do biorreator. As gotas também fornecem a capacidade de fundir novamente gotas em amostras aquosas maiores ou com outras gotas para estudos de sinalização intercelular. ^1,2 A redução na diluição implica sinais de detecção mais fortes para medições de maior precisão, bem como a capacidade de reduzir volumes de amostras e reagentes potencialmente caros. ³ O encapsulamento de células em gotas tem sido utilizado para melhorar a detecção da expressão de ^proteínas,4 anticorpos,5,6 enzimas,7^{e atividade metabólica8} para triagem de alto rendimento, e pode ser usado para melhorar a citometria de alto rendimento. ⁹ Estudos adicionais apresentam aplicações em bio-eletropulverização de células contendo gotas para espectrometria de massa¹⁰ e revestimentos de células de superfície direcionadas. ¹¹ Algumas aplicações, no entanto, foram limitadas pela falta de capacidade de controlar o número de células encapsuladas em gotas. Aqui apresentamos um método de encapsulamento ordenado¹² que aumenta as eficiências de encapsulamento demonstradas para uma e duas células e pode ser extrapolado para encapsulamento de um número maior de células.

Para alcançar a geração de gotas monodispersas, a "focalização de fluxo" microfluídica permite a criação de gotas de tamanho controlável de um fluido (uma mistura de células aquosas) dentro de outro (uma fase oleosa contínua) usando um bico no qual os fluxos convergem. ¹³ Para uma determinada geometria do bico, a frequência de geração de gotas f e o tamanho da gota podem ser alterados ajustando as taxas de fluxo aquoso e de óleo Q_óleo e Q_aq. À medida que as taxas de fluxo aumentam, os fluxos podem fazer a transição da geração de gotas para o jato instável de fluido aquoso do bico. ¹⁴

Quando a solução aquosa contém partículas suspensas, as partículas ficam encapsuladas e isoladas umas das outras no bico. Para a geração de gotas usando uma suspensão de células aquosas distribuídas aleatoriamente, a fração média de gotas D_k contendo k células é ditada pela estatística de Poisson, onde D_k = λ^k exp (-λ) / (k!) e λ é o número médio de células por gota. A fração de células que terminam nas gotas encapsuladas "corretamente" é calculada usando P_k = (k x D_k)/Σ(k' x D_k'). A diferença sutil entre as duas métricas é que D_k se relaciona com a utilização de fluido aquoso e a quantidade de classificação de gotas que deve ser concluída após o encapsulamento, e P_k se relaciona com a utilização da amostra de células. Como exemplo, pode-se usar uma suspensão celular diluída (λ baixo) para encapsular gotas onde a maioria das gotas contendo células conteria apenas uma célula. Embora a métrica de eficiência P_k seja alta, a maioria das gotas estaria vazia (D_k baixo), exigindo assim um mecanismo de classificação para remover gotas vazias, reduzindo também o rendimento. ¹⁵

A combinação da geração de gotas com ordenação inercial fornece a capacidade de encapsular gotas com números mais previsíveis de células por gota e taxas de transferência mais altas do que o encapsulamento aleatório. A focalização inercial foi descoberta pela primeira vez por Segre e Silberberg¹⁶ e refere-se à tendência de partículas de tamanho finito de migrar para posições de equilíbrio lateral no fluxo do canal. A ordenação inercial refere-se à tendência das partículas e células de se organizarem passivamente em trens de velocidade constante, escalonados e igualmente espaçados. Tanto o foco quanto a ordenação requerem taxas de fluxo suficientemente altas (alto número de Reynolds) e tamanhos de partícula (alto número de Reynolds de partículas). ^17,18 Aqui, o número de Reynolds Re = uD_h / ν e o número de Reynolds da partícula Rep = Re (a / D_h) ², onde u é uma velocidade de fluxo característica, D_h [= 2wh / (w + h)] é o diâmetro hidráulico, ν é a viscosidade cinemática, a é o diâmetro da partícula, w é a largura do canal e h é a altura do canal. Empiricamente, o comprimento necessário para atingir trens totalmente ordenados diminui à medida que Re e Re_p aumentam. Observe que os altos requisitos de Re e Re_p (para este estudo na ordem de 5 e 0,5, respectivamente) podem entrar em conflito com a necessidade de manter as taxas de fluxo aquoso baixas para evitar o jato no bico de geração de gotas. Além disso, altas taxas de fluxo levam a maiores tensões de cisalhamento nas células, que não são abordadas neste protocolo. O estudo de encapsulamento solicitado anteriormente demonstrou que mais de 90% das células HL60 encapsuladas isoladamente sob condições de fluxo semelhantes às deste estudo mantiveram a integridade da membrana celular. ¹² No entanto, o efeito da magnitude e das escalas de tempo das tensões de cisalhamento precisará ser cuidadosamente considerado ao extrapolar para diferentes tipos de células e parâmetros de fluxo. A sobreposição das restrições de taxa de fluxo aquoso de ordenação de células, geração de gotas e viabilidade celular fornece um regime operacional ideal para encapsulamento controlado de células únicas e múltiplas.

Como muito poucos estudos abordam o espaçamento entre ^{partículas,19,20} determinar o espaçamento é mais facilmente feito empiricamente e dependerá da geometria do canal, taxa de fluxo, tamanho de partícula e concentração de partículas. No entanto, o espaçamento lateral igual entre os trens implica que as células chegam a intervalos de tempo previsíveis e consistentes. Quando a geração de gotas ocorre na mesma taxa em que as células ordenadas chegam ao bico, as células ficam encapsuladas dentro da gota de maneira controlada. Essa técnica tem sido utilizada para encapsular células únicas com taxas de transferência da ordem de 15 ^kHz,12 uma melhoria significativa em relação a estudos anteriores que relataram taxas de encapsulamento da ordem de 60-160 ^Hz.4,15 No trabalho de encapsulamento controlado, mais de 80% das gotas continham uma e apenas uma célula, uma melhoria significativa de eficiência em relação às estatísticas de Poisson (aleatórias), que prevê menos de 40% de eficiência em média. ¹²

Em trabalhos anteriores de encapsulamento ^{controlado,12} o número médio de partículas por gota λ foi ajustado para fornecer encapsulamento de célula única. Nossa hipótese é que, por meio do ajuste das taxas de fluxo, podemos encapsular com eficiência qualquer número de células por gota quando λ é igual ou próximo ao número de células desejadas por gota. Embora o encapsulamento de célula única seja valioso para determinar as respostas celulares individuais a partir de estímulos, o encapsulamento de células múltiplas fornece informações relacionadas à interação de números e tipos controlados de células. Aqui apresentamos um protocolo, resultados representativos usando microesferas de poliestireno e discussão para encapsulamento controlado de múltiplas células usando um canal de ordenação inercial passivo e bico de geração de gotas.

Protocol

Os protocolos nesta secção descrever os materiais e equipamentos utilizados especificamente para obter os resultados experimentais apresentados. Note-se que os fornecedores alternativos para produtos químicos e os equipamentos podem ser utilizados.

1. Fabricação de dispositivos e litografia suave

Técnicas padrão de litografia suave, ²¹ um número de que foram caracterizados em artigos Jové anteriores, ²² foram utilizados para a criação de polidimetilsiloxano (PDMS) redes de microcanais ligados a substratos de vidro. Além de mestre fabricação de moldes de réplica por SU-8 fotolitografia, os processos podem ser realizados fora de uma sala limpa ou capuz limpo, no entanto, poeiras e partículas deve ainda ser minimizada para alcançar resultados consistentes.

1. Conceber um padrão de micro-canais, como mostrado na Figura 1 em AutoCAD (AutoDesk Inc.). Empregar um fabricante terceiro (Fineline Imaging Inc.) para imprimir uma alta resolução (50.000 dpi) transmáscara de transparência em filme Mylar ou de quartzo, onde os canais são transparentes sobre um fundo escuro.
2. Criar um silício e SU-8 mestre fotorresiste para a moldagem de réplica. Resumidamente, girar SU-8 2050 (Microchem) fotorresiste negativo com rpm recomendado pelo fabricante sobre um spin-coater para criar uma camada de 52 mM de espessura em uma superfície limpa de 7,5 cm ou 10 wafer de silício cm. Depois de cozer macio, borda interna do cordão de, exposição aos raios UV através de uma máscara de contato, pós-exposição cozer, desenvolvimento e exposição de inundação, medir a espessura real da camada SU-8 usando um perfilômetro Dektak (Veeco). Tape o molde mestre para o fundo de um 4 "ou 5" placa de Petri para preparar PDMS moldagem de réplica.
3. Mix base de elastómero de PDMS com o agente de cura de elastómero (Dow Corning) em uma razão de 10:1 de base w / w para agente de cura. Verter bem misturada precursor PDMS para o mestre de silício para criar uma camada de espessura de 2-3 mm final. Uma mistura de 20 g de base de elastómero com 2 g do agente de cura é suficiente para cobrir uma superfície de diâmetro 4 ".
4. Coloque a master molde e PDMS em exsicador de vácuo (Jencons) para o PDMS de-gás não curado. Usando um regulador de pressão (Cole Parmer), lentamente diminuir a pressão manométrica câmara de 0 "Hg para -27" Hg durante 20 minutos para evitar a excessiva formação de espuma. Deixar dispositivo na câmara de vácuo a -27 "Hg durante 30 minutos ou até que as bolhas de ar desaparecer.
5. Libertação de vácuo e mover o molde mestre e PDMS para um forno de 65 ° C (Thermo Scientific) para um mínimo de quatro horas. O dispositivo pode ser deixado no forno durante a noite para melhorar a cura.
6. Remova o dispositivo de forno e deixa-se arrefecer. Corte com cuidado em torno de PDMS wafer circular usando uma faca de precisão e casca fora PDMS. Cortar contorno dispositivo como mostrado na Figura 1 com um bisturi.
7. Portas de perfurador fluídicos (três por dispositivo) nas três regiões redondos mostrados na Figura 1, usando um punção de biópsia. Para este dispositivo, usar um 0,75 milímetros de diâmetro exterior perfurador (Harris).
8. Respeite fita adesiva para o lado modelado do PDMS e casca para remover qualquerpó. Como uma alternativa de redução de custos, mas viável para aparelhos de plasma convencionais de oxigênio, ^21,22 plasma tratar o lado modelado do PDMS e um 3 limpa "x 1" lâmina de vidro usando um hand-held laboratório corona tratador (Electro-Technic Products Inc .) ^23. Note-se que este dispositivo deve ser utilizado em um exaustor ou área bem ventilada devido à descarga de ozônio, e todos os relógios e telefones celulares devem ser mantidos pelo menos dez metros de distância. Ajustar a descarga de coroa para atingir uma coroa estável com o mínimo de faíscas. Lentamente acenar o eletrodo aproximadamente 1/4 "acima de cada superfície de cerca de 20 segundos e logo em seguida trazer as superfícies tratadas em contato para formar um forte vínculo permanente antes de as superfícies de PDMS retornar ao seu estado nativo.
9. Coloque o dispositivo sobre uma placa de metal, lugar num forno de fresco, definir o forno a 120 ° C, e cozer durante a noite para completar a ligação e para retornar o PDMS ao seu estado hidrofóbico original. ²⁴ Durante este fermento de alta temperatura, tele superfície de vidro do canal também ser processado hidrofóbico devido à deposição de uma camada hidrofóbica fina sobre o vidro. Alternativamente, os revestimentos hidrofóbicos tais como Aquapel (PPG Industries) pode ser injectado nas portas fluídicos usando uma seringa de 1 mL e uma agulha de seringa ^12. Cuidadosamente, mas firmemente injectar a Aquapel seguido por purga de ar para as portas fluídicos sem quebrar o vínculo PDMS ao vidro . Agressivamente repetir a purga de ar em todas as portas de entrada e saída, enquanto limpando qualquer Aquapel excesso, a fim de evitar quaisquer depósitos que podem entupir os canais de secagem.

2. Preparação da Amostra

1. Prepara-se uma cultura de células de acordo com procedimentos estabelecidos para o seu tipo de célula escolhido. Para o dispositivo particular usado neste estudo, 8-15 uM partículas ou células devem adequadamente requisitar para encapsulamento. Tipos de células menores ou maiores podem exigir alterar as dimensões do canal de focagem para alcançar _p Re adequada. Para o meresultados de demonstração Thod mostrados neste trabalho, 9,9 mM de poliestireno microesferas (G1000, Thermo Scientific) são utilizados como substitutos das células.
2. Preparar a partícula aquosa ou suspensão de células através de agitação suave. Quando se utiliza células ou partículas de poliestireno, o controlo de concentração é essencial (ver Figura 4) para alcançar o encapsulamento ordenados ideal. Usando os dados anteriores ¹² como um guia, calcular a célula desejado ou concentração de partículas com base no espaçamento trem ordenada e tamanho do canal de micro-como: uma célula ou partícula por esperados vezes trem longitudinais de espaçamento a concentração de canal na área de corte transversal. Se a concentração de estoque (1% w / w) é inadequado, aumentar a concentração (aqui a 1,5% w / w) suavemente por centrifugação da amostra banco de remoção de líquido sobrenadante, e re-suspensão das partículas por vórtice de mistura, ou mais suave mistura quando se utiliza células. Preparar um volume adequado de conta para o volume desejado e recolha para o tempo de execução associado com flow sintonia.
3. Ambas as células e partículas de poliestireno têm um peso específico maior do que um. Apesar de não ser demonstrado neste protocolo, a longo prazo experiências com uma duração da ordem de vários minutos a horas, a flutuabilidade coincidir com a solução pela adição de um soluto tal como CaCl ₂ para partículas ou OptiPrep (Sigma-Aldrich) para as células.
4. Prepara-se uma amostra de 10 mL da fase contínua de óleo de fluorocarbono por mistura do óleo de fluorocarbono FC-40 (3M) e PFPE-PEG bloco tensioactivo de copolímero ²⁵ (2,5% w / w) (Raindance Technologies) em um tubo de centrífuga de 15 mL. Alternativamente, o óleo mineral leve (Chemicals Processo PTI) pode ser utilizado com ABIL-EM surfactante 90 (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).

3. Instalação Experimental

1. Ligue o microscópio óptico invertido (Axio Observer, Zeiss) e câmera de alta velocidade (Phantom V310, Vision Research). Concentre-se e inspecionar os canais de tamancos e detritos por qualquer mover manualmente o dispositivo ouusando um microscópio de fase motorizado. Alguns fragmentos pequeno pode ser empurrado para fora quando o líquido flui através de. Para partículas grandes ou tamancos óbvias, selecione outro canal no dispositivo como detritos no canal de focagem pode degradar significativamente a qualidade ordenação. Note-se que obstruções pode muitas vezes ser removido sob fluxo pressionando firmemente na superfície PDMS acima da região afectada com uma pinça romba.
2. Corte três pedaços de tubos de PVC (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) para a entrada aquoso, óleo de entrada e saída de emulsão. Para minimizar o volume morto, cortado apenas o suficiente para alcançar tubagem a partir das bombas de seringa para a platina do microscópio. Cortar as extremidades de tubos a um ângulo de 45 ° para facilitar a inserção em portos fluídicos.
3. Use pinças para pressionar encaixar o tubo termina nas portas fluídicos perfurados no Passo 1 e pressione encaixar dois calibre 30 blunt-ponteira de aço inoxidável agulhas de seringa de aço (SmallParts) nas extremidades livres do aquosa respectivo e os tubos de alimentação de óleo (não necessário adesivo) . Colocar o tubo de saída para um r resíduoseservoir. Este tubo irá mais tarde ser movido para um reservatório de recolha.
4. Mova o dispositivo ea tubulação em anexo ao estágio do microscópio, alinhar e focar o bico dispositivo usando um objetivo disponível (20x foi utilizado para este experimento). Ajustar para K hler iluminação e configurações microscópio outros, conforme necessário para uma excelente gravação.
5. Encher uma seringa de 1 mL (BD) com a fase aquosa bem misturada e uma seringa de 3 ml (BD) com a solução de fase oleosa preparada no Passo 2. Observe que todas as seringas de qualquer volume pode ser usado e deve ser cuidadosamente selecionados em função dos tempos de execução desejados e minimização de qualquer pulsatilidade. Incline uma seringa na vertical e um ligeiro toque para mover as bolhas de ar à saída de seringa. Lentamente deprimir êmbolo suficiente para empurrar o ar para a ponta da seringa. Segurando a seringa na vertical, ligar as seringas para a agulha da seringa respectivo já ligado ao dispositivo no Passo 3,3. Deprimir êmbolo para forçar o ar através do volume morto agulha de seringa até que o fluido é pushed através da tubagem quase para o dispositivo. Firmemente montar a seringa a uma bomba de seringa (Nexus 3000, Chemyx) e envolver o bloco êmbolo. Repita as ligações para a segunda seringa e montar a uma bomba de seringa segundo.
6. Potência em cada bomba de seringa e programa usando os protocolos do fabricante da bomba. Estabelecer as taxas de fluxo inicial de Q _óleo = 50 uL / min e Q _aq = 5 uL / min para a fase de óleo e fase aquosa, respectivamente. Iniciar as bombas.
7. Espere para cada fluido para introduzir o dispositivo e preencher os canais, empurrando para fora o ar morto restante. Isso pode levar vários minutos. Se houver uma grande quantidade de ar na tubagem de entrada, aumentar temporariamente a cada taxa de fluxo até que o ar é expelido. Não aumente as taxas de fluxo tão alto que as pressões ocorrem grandes no canal, levando potencialmente a PDMS-para-vidro falha vínculo.
8. Usando as taxas de fluxo inicial, observar a formação de gotas no bico (resultados mostrados aqui: 20x magnification, frame rate 21005 fps, exposição 3 mS). Reduzir o campo de vista da câmera para apenas o bocal para maximizar a taxa de frame e reduzir os requisitos de memória, se possível. Captura vídeos de amostra e confirmar que a taxa de amostragem é adequada para evitar aliasing.
9. Para evitar a jacto (ver Figura 2), começar com baixas taxas de fluxo aquoso. Lentamente, aumentar a taxa de fluxo aquoso para observar ordenação de partículas no canal de solução aquosa de longo com o aumento da taxa de fluxo.
10. Se a concentração de partículas é demasiado baixo para proporcionar comboios com relativamente poucos "em falta" partículas e da amostra não foi flutuabilidade encontrados, fisicamente inclinar a bomba de seringa para a saída da seringa para proporcionar gradual sedimentação de partículas para a saída de uma seringa. Este método é demonstrado no protocolo de vídeo. Periodicamente rotativo a seringa ao longo do seu eixo pode também reduzir a sedimentação indesejada.
11. Uma vez ordenação adequada ocorre, ajustar a taxa de fluxo de óleo para sintonizar a frequência de geração etamanho de gotas. O volume da gota média pode ser calculado utilizando a taxa de fluxo aquoso dividido pela frequência geração gota como medido por captura de vídeo. Iterativamente ajustar as taxas de ambos os fluxos de atingir taxas de encapsulamento desejados e volumes de gota.
12. Uma vez estável de encapsulação é confirmada ordenada, mover o tubo de saída a partir do reservatório de resíduos para um reservatório de recolha ou alimentá-lo em outro dispositivo para teste subsequente.
13. Determinar o tempo de recolha com base no número desejado de gotículas e da frequência de geração calculada.
14. Gravar a fracção de gotas contendo 0, 1, 2, ..., N partículas para quantificar a eficiência usando quer gota video resultados da produção ou por pipetagem de uma amostra de emulsão recolhidos para inspecção.

4. Os resultados representativos

Os resultados são apresentados que alcançar tanto controlada de partícula única e controlada de encapsulação de duplo de partícula (Figura 3). Ao cortara taxa de fluxo de FC-40 óleo em meia, uma única partícula de encapsulação torna-se dois-partícula de encapsulação. Por outro lado, poderíamos ter aumentado a taxa de fluxo aquoso para fornecer partículas para o bico mais rapidamente, mas também teria aumentado o risco de ejecção do fluxo aquoso. Histogramas da Figura 3 apresenta o número fraccionário de partículas por gota para os dois casos, juntamente com as comparações com estatística de Poisson. As gotas ocasionais com partículas de zero são principalmente devido à "faltando" partículas nos comboios ordenadas, enquanto que os casos em que existem partículas mais do que encapsulados resultado desejado a partir de locais altas concentrações de partículas e as partículas que, por vezes, migram para uma das duas posições verticais de focagem. Note-se que a flutuabilidade correspondente conforme descrito na Seção 2, não foi utilizado. Em vez disso, a bomba de seringa foi fisicamente inclinada para permitir sedimentação de partículas para a saída da seringa, levando a uma elevada concentração de partículas durante a corrida.

Figura 4. Sem ordenação completa, os grupos localizados de forma de partículas e são encapsulados, mas muitas gotas são sem partículas. Um histograma mostra a diminuição da eficiência de encapsulação para o encapsulamento de partícula desejado dois.

Figura 1. Dispositivo de encapsulamento. a) dispositivo geral com entradas, saída, e canal de ordenação muito tempo. A altura do dispositivo é de 52 mM ea largura do canal ordenação é de 27 mM. b) Tanto aquosa e as entradas de óleo têm filtros detritos grandes com aberturas do fim da largura do canal ordenar para o ponto de vista ampliada da entrada de óleo. c) A vista alargada do bico mostra larguras de canal iguais de 27 mm para os canais aquosos e óleo, seguido pela contracção do bocal de 22 uM e expansão súbita de um canal mais largo iM 61.Note-se que as dimensões do dispositivo mostrado aqui foram verificados utilizando um perfilómetro após microfabricação e diferem um pouco das dimensões nominais da máscara. A verdadeira imagem do canal de ordenação e bico estão disponíveis on-line como Suplementar Figura 1 . A máscara de arquivo AutoCAD também foi incluída on-line como um complemento a este manuscrito.

Figura 2. Histerese de um gotejamento para a transição de jacto usando um mais amplo do dispositivo (80 mM de largura x 22 uM alta). a) Para a taxa de FC-40 de fluxo constante (Q _óleo = 45 uL / min), a formação de gota constante ocorre a 10 kHz utilizando uma solução aquosa caudal Q _aq = 8 uL / min. Como a taxa de fluxo aquosa é lentamente aumentada para 10 e mu; L / min, ejecção do fluxo de fluido aquoso é disparado. b) Quando a taxa de fluxo é retornado a 8 mL / min de jacto continua. Note-se que a formação de gota constante pode ser re-estabelecido, por breves instantes parando a bomba de fluxo aquoso (uma pausa de 1 segundo é típico).

Figura 3. Encapsulação simples e dupla-partícula. Uma formação da gota) com uma célula por gota (Q _óleo = 60 uL / min, Q _aq = 9 mL / min) com uma taxa de geração de gota de 6,1 kHz, o tamanho médio de gota 24,4 pL, e uma eficiência de captura de uma única célula D _k = 79,5% e P _k = 83,7% (λ = 0,95) para um tamanho de amostra de n _d = 517 gotas e n _​​p = 491 partículas formação da gota. b) com duas células por gota é conseguido simplesmente por redução da FC-40 caudal _{de óleo} Q para 30 μL / min. As maiores (39,8 pL) gotas são formados a uma taxa de 3,8 kHz com uma eficiência de captura de duas células D _k = 71,5% e P _k = 79,5% (λ = 1,80) para um tamanho de amostra de _n D = 383 gotas e n _p = 689 partículas. CD) Dois histogramas comparar as eficiências de encapsulação de queda de partículas de D _k ordenou encapsulamento simples e duplo de partículas, com estatística de Poisson (encapsulamento aleatório). Note-se que para ambos os casos, o espaçamento de partícula na direcção do fluxo é de cerca de 17-18 mm para totalmente ordenadas, as partículas alternados. Vídeos Suplementares mostrando tanto o encapsulamento de um único e duplo-partícula estão disponíveis online. Clique aqui para ver 3 filmes complementares . Clique aqui para ver 3b filme Suplementares .

Concentração Figura 4. Afecta grandemente a eficiência de encapsulamento. A) Como as reduções de concentração, ordenação completa não ocorre, e assim "buracos" nos trens emergir, deixando algumas gotas com menos do que as partículas previstas. B) O histograma mostra a eficiência diminuiu ( D _k = 55,9%, P _k = 70,9%) para dois-partícula de encapsulação devido a um valor mais baixo de λ = 1,57, onde há quase a mesma quantidade de partículas de um único cai como existem duas vezes de partículas gotas. Isto resulta a partir de _óleo figura Q = 30 uL / min e Q _aq = 9 mL / min, as condições de escoamento mesmas para Figura 3b. Um vídeo representante suplementar está disponível online. Clique aqui para ver 4 Movie Suplementar .

Discussion

Apesar graus relativamente elevados de ordenação, nem todos os gotas conterá o número apropriado de partículas ou células. Eficiência de encapsulação pode ser calculada como o número de células ou partículas que ficam encapsulados em gotas com a ocupação desejado dividido pelo seu número total. Estes dados em bruto pode ser obtido quer a partir de um algoritmo de vídeo de alta velocidade automático ou de imagiologia de uma amostra de emulsão recolhida. Isto pode ser comparado com a fracção de partículas de ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
AutoCAD	AutoDesk
Máscara de transparência	Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist	Microchem	2050
Profilometer Dektak	Veeco
Placa de Petri	BD Falcon	351058
PDMS Kit Elastômero de Silicone	A Dow Corning Corp	Sylgard 184, número de material (240) 4019862
Exsicador de vácuo	Jencons	250-030
Bomba de vácuo	Alcatel Vacuum Technology	2010 C2
Regulador de vácuo	Cole-Parmer	EW-00910-10
Forno	Thermo Scientific	Lindberg Blue M, OV800F
Biópsia com punch, 0,75 mm	Harris	Uni-Core 15072
Laboratório de Corona Treater	Electro-Technic Products Inc.	BD-20AC, SKU 12051A
Lâminas de vidro	Gold Seal	3010
Aquapel	PPG Industries		Estratégia Alternativa
Microesferas de poliestireno, 9,9 mM	Thermo	G1000
OptiPrep	Sigma-Aldrich	D1556	Não demonstraram
Luer-Lok Seringas	BD	1 mL: 309,628 3 mL: 309,585
FC-40 Óleo Fluorocarbon	3M Inc.	Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG fluorotensioactivo	Raindance Technologies
Óleo Mineral Luz	Processos Químicos PTI	08042-47-5	Estratégia Alternativa
Surfactante Óleo Mineral	Evonik Goldschmidt Corporação	ABIL EM 90	Estratégia Alternativa
Tygon Tubing PVC	SmallParts	TGY-010
Calibre 30 Luer-Lok Seringa Agulha, 1/2 "	SmallParts	NE-301PL-C
Microscópio invertido	Carl Zeiss imagem	Axio Observer.Z1
Câmera de alta velocidade	Vision Research	Fantasma V310
Bombas de seringa (2)	Chemyx Inc.	Nexus 3000
Óleo de silicone	A Dow Corning	200 de fluido, a 10 cSt	Opcional para armazenamento de emulsão