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Os métodos de encapsulamento microfluídico foram utilizados anteriormente para capturar células em gotas aquosas e monodispersas em escala de picolitros, proporcionando confinamento de um ambiente de fluido a granel com aplicações em triagem de alto rendimento, citometria e espectrometria de massa. Descrevemos um método não apenas para encapsular células únicas, mas para capturar repetidamente um número definido de células (aqui demonstramos o encapsulamento de uma e duas células) para estudar o isolamento e as interações entre as células em grupos de tamanhos controlados. Ao combinar técnicas de geração de gotas com ordenação de células e partículas, demonstramos o encapsulamento controlado de partículas do tamanho de células para encapsulamento eficiente e contínuo. Usando uma suspensão aquosa de partículas e óleo de fluorocarbono imiscível, geramos gotas aquosas de óleo com um bico de foco de fluxo. A taxa de fluxo aquoso é suficientemente alta para criar ordenação de partículas que atingem o bico em frequências múltiplas inteiras da frequência de geração de gotas, encapsulando um número controlado de células em cada gota. Para resultados representativos, partículas de poliestireno de 9,9 μm são usadas como substitutos celulares. Este estudo mostra uma eficiência de encapsulamento de partícula única Pk = 1 de 83,7% e uma eficiência de encapsulamento de partícula dupla Pk = 2 de 79,5% em comparação com suas respectivas eficiências de Poisson de 39,3% e 33,3%, respectivamente. O efeito da concentração consistente de células e partículas é demonstrado como de grande importância para o encapsulamento eficiente, e as transições de gotejamento para jateamento também são abordadas.
Introdução
As suspensões de células aquosas de meios contínuos compartilham um ambiente fluido comum que permite que as células interajam em paralelo e também homogeneíza os efeitos de células específicas nas medições do meio. O encapsulamento de alto rendimento de células em gotas em escala de picolitro confina as amostras para proteger as gotas da contaminação cruzada, permite uma medida da diversidade celular dentro das amostras, evita a diluição de reagentes e biomarcadores expressos e amplifica os sinais dos produtos do biorreator. As gotas também fornecem a capacidade de fundir novamente gotas em amostras aquosas maiores ou com outras gotas para estudos de sinalização intercelular. 1,2 A redução na diluição implica sinais de detecção mais fortes para medições de maior precisão, bem como a capacidade de reduzir volumes de amostras e reagentes potencialmente caros. 3 O encapsulamento de células em gotas tem sido utilizado para melhorar a detecção da expressão de proteínas,4 anticorpos,5,6 enzimas,7e atividade metabólica8 para triagem de alto rendimento, e pode ser usado para melhorar a citometria de alto rendimento. 9 Estudos adicionais apresentam aplicações em bio-eletropulverização de células contendo gotas para espectrometria de massa10 e revestimentos de células de superfície direcionadas. 11 Algumas aplicações, no entanto, foram limitadas pela falta de capacidade de controlar o número de células encapsuladas em gotas. Aqui apresentamos um método de encapsulamento ordenado12 que aumenta as eficiências de encapsulamento demonstradas para uma e duas células e pode ser extrapolado para encapsulamento de um número maior de células.
Para alcançar a geração de gotas monodispersas, a "focalização de fluxo" microfluídica permite a criação de gotas de tamanho controlável de um fluido (uma mistura de células aquosas) dentro de outro (uma fase oleosa contínua) usando um bico no qual os fluxos convergem. 13 Para uma determinada geometria do bico, a frequência de geração de gotas f e o tamanho da gota podem ser alterados ajustando as taxas de fluxo aquoso e de óleo Qóleo e Qaq. À medida que as taxas de fluxo aumentam, os fluxos podem fazer a transição da geração de gotas para o jato instável de fluido aquoso do bico. 14
Quando a solução aquosa contém partículas suspensas, as partículas ficam encapsuladas e isoladas umas das outras no bico. Para a geração de gotas usando uma suspensão de células aquosas distribuídas aleatoriamente, a fração média de gotas Dk contendo k células é ditada pela estatística de Poisson, onde Dk = λk exp (-λ) / (k!) e λ é o número médio de células por gota. A fração de células que terminam nas gotas encapsuladas "corretamente" é calculada usando Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). A diferença sutil entre as duas métricas é que Dk se relaciona com a utilização de fluido aquoso e a quantidade de classificação de gotas que deve ser concluída após o encapsulamento, e Pk se relaciona com a utilização da amostra de células. Como exemplo, pode-se usar uma suspensão celular diluída (λ baixo) para encapsular gotas onde a maioria das gotas contendo células conteria apenas uma célula. Embora a métrica de eficiência Pk seja alta, a maioria das gotas estaria vazia (Dk baixo), exigindo assim um mecanismo de classificação para remover gotas vazias, reduzindo também o rendimento. 15
A combinação da geração de gotas com ordenação inercial fornece a capacidade de encapsular gotas com números mais previsíveis de células por gota e taxas de transferência mais altas do que o encapsulamento aleatório. A focalização inercial foi descoberta pela primeira vez por Segre e Silberberg16 e refere-se à tendência de partículas de tamanho finito de migrar para posições de equilíbrio lateral no fluxo do canal. A ordenação inercial refere-se à tendência das partículas e células de se organizarem passivamente em trens de velocidade constante, escalonados e igualmente espaçados. Tanto o foco quanto a ordenação requerem taxas de fluxo suficientemente altas (alto número de Reynolds) e tamanhos de partícula (alto número de Reynolds de partículas). 17,18 Aqui, o número de Reynolds Re = uDh / ν e o número de Reynolds da partícula Rep = Re (a / Dh) 2, onde u é uma velocidade de fluxo característica, Dh [= 2wh / (w + h)] é o diâmetro hidráulico, ν é a viscosidade cinemática, a é o diâmetro da partícula, w é a largura do canal e h é a altura do canal. Empiricamente, o comprimento necessário para atingir trens totalmente ordenados diminui à medida que Re e Rep aumentam. Observe que os altos requisitos de Re e Rep (para este estudo na ordem de 5 e 0,5, respectivamente) podem entrar em conflito com a necessidade de manter as taxas de fluxo aquoso baixas para evitar o jato no bico de geração de gotas. Além disso, altas taxas de fluxo levam a maiores tensões de cisalhamento nas células, que não são abordadas neste protocolo. O estudo de encapsulamento solicitado anteriormente demonstrou que mais de 90% das células HL60 encapsuladas isoladamente sob condições de fluxo semelhantes às deste estudo mantiveram a integridade da membrana celular. 12 No entanto, o efeito da magnitude e das escalas de tempo das tensões de cisalhamento precisará ser cuidadosamente considerado ao extrapolar para diferentes tipos de células e parâmetros de fluxo. A sobreposição das restrições de taxa de fluxo aquoso de ordenação de células, geração de gotas e viabilidade celular fornece um regime operacional ideal para encapsulamento controlado de células únicas e múltiplas.
Como muito poucos estudos abordam o espaçamento entre partículas,19,20 determinar o espaçamento é mais facilmente feito empiricamente e dependerá da geometria do canal, taxa de fluxo, tamanho de partícula e concentração de partículas. No entanto, o espaçamento lateral igual entre os trens implica que as células chegam a intervalos de tempo previsíveis e consistentes. Quando a geração de gotas ocorre na mesma taxa em que as células ordenadas chegam ao bico, as células ficam encapsuladas dentro da gota de maneira controlada. Essa técnica tem sido utilizada para encapsular células únicas com taxas de transferência da ordem de 15 kHz,12 uma melhoria significativa em relação a estudos anteriores que relataram taxas de encapsulamento da ordem de 60-160 Hz.4,15 No trabalho de encapsulamento controlado, mais de 80% das gotas continham uma e apenas uma célula, uma melhoria significativa de eficiência em relação às estatísticas de Poisson (aleatórias), que prevê menos de 40% de eficiência em média. 12
Em trabalhos anteriores de encapsulamento controlado,12 o número médio de partículas por gota λ foi ajustado para fornecer encapsulamento de célula única. Nossa hipótese é que, por meio do ajuste das taxas de fluxo, podemos encapsular com eficiência qualquer número de células por gota quando λ é igual ou próximo ao número de células desejadas por gota. Embora o encapsulamento de célula única seja valioso para determinar as respostas celulares individuais a partir de estímulos, o encapsulamento de células múltiplas fornece informações relacionadas à interação de números e tipos controlados de células. Aqui apresentamos um protocolo, resultados representativos usando microesferas de poliestireno e discussão para encapsulamento controlado de múltiplas células usando um canal de ordenação inercial passivo e bico de geração de gotas.