Combinando monodispersos geração gota com ordenação de inércia de células e partículas, nós descrevemos um método para encapsular um número desejado de células ou partículas em uma única gota a taxas kHz. Nós demonstramos a eficiência duas vezes superiores às de encapsulamento desordenada para gotas simples e dupla-partícula.
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Artigo de método
Alta taxa de transferência de célula única e múltipla de células Micro-encapsulamento
Neste artigo
Resumo
Resumo
Métodos de encapsulação microfluídica já foram utilizados anteriormente para capturar células em gotas aquosas monodispersas na escala de picolitros, proporcionando confinamento a partir de um ambiente fluido em volume, com aplicações em triagem de alto rendimento, citometria e espectrometria de massas. Descrevemos um método para não apenas encapsular células individuais, mas também capturar repetidamente um número determinado de células (aqui demonstramos encapsulação de uma e duas células) a fim de estudar tanto o isolamento quanto as interações entre células em grupos de tamanhos controlados. Ao combinar técnicas de geração de gotas com ordenação de células e partículas, demonstramos a encapsulação controlada de partículas de tamanho celular para uma encapsulação eficiente e contínua. Utilizando uma suspensão aquosa de partículas e óleo de fluorocarbono imiscível, geramos gotas aquosas em óleo com um bico de focagem de fluxo. A taxa de fluxo aquoso é suficientemente alta para criar o ordenamento de partículas que alcançam o bico em frequências múltiplas inteiras da frequência de geração de gotas, encapsulando um número controlado de células em cada gota. Para resultados representativos, partículas de poliestireno de 9,9 μm são utilizadas como substitutas de células. Este estudo mostra uma eficiência de encapsulação de partícula única Pk=1 de 83,7% e uma eficiência de encapsulação de dupla partícula Pk=2 de 79,5%, comparadas às respectivas eficiências de Poisson de 39,3% e 33,3%. Demonstra-se que a concentração constante de células e partículas é de grande importância para uma encapsulação eficiente, e as transições de gotejamento para jato também são abordadas.
Introdução
Suspendões celulares aquosas em meio contínuo compartilham um ambiente fluido comum que permite interações paralelas entre células e também homogeneiza os efeitos de células específicas nas medições realizadas no meio. O encapsulamento em alto rendimento de células em gotículas na escala de picolitros confina as amostras, protegendo-as contra contaminação cruzada, permitindo uma avaliação da diversidade celular dentro das amostras, evitando a diluição de reagentes e biomarcadores expressos e amplificando sinais provenientes de produtos de biorreatores. As gotículas também possibilitam a reunião novamente de gotículas em amostras aquosas maiores ou com outras gotículas, para estudos de sinalização intercelular.1,2 A redução na diluição implica sinais de detecção mais fortes, permitindo medições com maior precisão, além da possibilidade de reduzir volumes de amostras e reagentes, potencialmente onerosos.3 O encapsulamento de células em gotículas tem sido utilizado para aprimorar a detecção de expressão proteica,4 anticorpos,5,6 enzimas,7 e atividade metabólica8 em triagens de alto rendimento, e poderia ser empregado para melhorar a citometria de alto rendimento.9 Estudos adicionais apresentam aplicações na bioeletrosspraya de gotículas contendo células para espectrometria de massas10 e revestimentos celulares superficiais direcionados.11 Algumas aplicações, contudo, têm sido limitadas pela incapacidade de controlar o número de células encapsuladas nas gotículas. Aqui apresentamos um método de encapsulamento ordenado12 que aumenta as eficiências de encapsulamento demonstradas para uma e duas células e que pode ser extrapolado para o encapsulamento de um número maior de células.
Para obter a geração de gotas monodispersas, a técnica microfluídica de "focalização de fluxo" permite a criação de gotas de tamanho controlável de um fluido (uma mistura aquosa de células) dentro de outro (uma fase contínua de óleo) por meio de um bico no qual os fluxos convergem.13 Para uma geometria de bico específica, a frequência de geração de gotas f e o tamanho das gotas podem ser alterados ajustando-se as taxas de fluxo do óleo e da fase aquosa Qoil e Qaq. À medida que as taxas de fluxo aumentam, os fluxos podem transitar da geração de gotas para a ejeção instável do fluido aquoso a partir do bico.14
Quando a solução aquosa contém partículas suspensas, as partículas ficam encapsuladas e isoladas umas das outras no bico. Para a geração de gotas usando uma suspensão celular aquosa distribuída aleatoriamente, a fração média de gotas Dk contendo k células é determinada pelas estatísticas de Poisson, onde Dk = λk exp(-λ)/(k!) e λ é o número médio de células por gota. A fração de células que acabam nas gotas encapsuladas "corretamente" é calculada usando Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). A diferença sutil entre as duas métricas é que Dk está relacionada ao aproveitamento do fluido aquoso e à quantidade de separação de gotas que deve ser realizada após o encapsulamento, enquanto Pk está relacionada ao aproveitamento da amostra celular. Como exemplo, poder-se-ia usar uma suspensão celular diluída (baixo λ) para encapsular gotas nas quais a maioria das gotas contendo células teria apenas uma célula. Embora a métrica de eficiência Pk fosse alta, a maioria das gotas estaria vazia (baixo Dk), exigindo, portanto, um mecanismo de separação para remover as gotas vazias, o que também reduziria a produtividade.15
A combinação da geração de gotas com ordenamento inercial permite encapsular gotas com números mais previsíveis de células por gota e maiores produtividades do que o encapsulamento aleatório. A focalização inercial foi descoberta inicialmente por Segre e Silberberg16 e refere-se à tendência de partículas de tamanho finito migrarem para posições laterais de equilíbrio em escoamentos em canal. O ordenamento inercial refere-se à tendência das partículas e células se organizarem passivamente em fileiras igualmente espaçadas, escalonadas e com velocidade constante. Tanto a focalização quanto o ordenamento exigem taxas de fluxo suficientemente altas (alto número de Reynolds) e tamanhos de partículas elevados (alto número de Reynolds da partícula)17,18. Aqui, o número de Reynolds Re =uDh/ν e o número de Reynolds da partícula Rep =Re(a/Dh)2, onde u é uma velocidade característica do fluxo, Dh [=2wh/(w+h)] é o diâmetro hidráulico, ν é a viscosidade cinemática, a é o diâmetro da partícula, w é a largura do canal e h é a altura do canal. Empiricamente, o comprimento necessário para atingir fileiras totalmente ordenadas diminui com o aumento de Re e Rep. Observe que os requisitos de altos valores de Re e Rep (nesta pesquisa da ordem de 5 e 0,5, respectivamente) podem conflitar com a necessidade de manter baixas as taxas de fluxo aquoso para evitar a formação de jatos na ponteira de geração de gotas. Além disso, altas taxas de fluxo provocam maiores tensões de cisalhamento nas células, as quais não são abordadas neste protocolo. O estudo prévio de encapsulamento ordenado demonstrou que mais de 90% das células HL60 encapsuladas individualmente, sob condições de fluxo semelhantes às deste estudo, mantiveram a integridade da membrana celular12. Contudo, o efeito da magnitude e das escalas de tempo das tensões de cisalhamento precisará ser cuidadosamente considerado ao extrapolar para diferentes tipos celulares e parâmetros de fluxo. A sobreposição das restrições de ordenamento celular, geração de gotas e viabilidade celular em relação à taxa de fluxo aquoso fornece um regime operacional ideal para o encapsulamento controlado de uma ou múltiplas células.
Como pouquíssimos estudos abordam o espaçamento entre trens de partículas,19,20 a determinação desse espaçamento é mais facilmente realizada de forma empírica e dependerá da geometria do canal, da taxa de fluxo, do tamanho das partículas e da concentração das partículas. Apesar disso, o espaçamento lateral igual entre os trens implica que as células chegam em intervalos de tempo previsíveis e consistentes. Quando a geração de gotas ocorre na mesma taxa com que as células ordenadas chegam ao bico, as células são encapsuladas dentro das gotas de maneira controlada. Essa técnica tem sido utilizada para encapsular células individuais com produtividades da ordem de 15 kHz,12 uma melhoria significativa em comparação com estudos anteriores que relataram taxas de encapsulação da ordem de 60–160 Hz.4,15 No trabalho de encapsulação controlada, mais de 80% das gotas continham uma e apenas uma célula, uma melhoria significativa em eficiência em relação à estatística de Poisson (aleatória), que prevê menos de 40% de eficiência em média.12
Em trabalhos anteriores de encapsulação controlada,12 o número médio de partículas por gota λ foi ajustado para proporcionar encapsulação de célula única. Hipotetizamos que, mediante o ajuste das taxas de fluxo, podemos encapsular eficientemente qualquer número de células por gota quando λ é igual ou próximo ao número desejado de células por gota. Embora a encapsulação de célula única seja valiosa para determinar as respostas individuais das células a estímulos, a encapsulação de múltiplas células fornece informações relacionadas à interação entre números e tipos controlados de células. Aqui apresentamos um protocolo, resultados representativos utilizando microesferas de poliestireno e discussão sobre a encapsulação controlada de múltiplas células usando um canal passivo de ordenação inercial e um bico gerador de gotas.
Protocolo
Os protocolos nesta secção descrever os materiais e equipamentos utilizados especificamente para obter os resultados experimentais apresentados. Note-se que os fornecedores alternativos para produtos químicos e os equipamentos podem ser utilizados.
1. Fabricação de dispositivos e litografia suave
Técnicas padrão de litografia suave, 21 um número de que foram caracterizados em artigos Jové anteriores, 22 foram utilizados para a criação de polidimetilsiloxano (PDMS) redes de microcanais ligados a substratos de vidro. Além de mestre fabricação de moldes de réplica por SU-8 fotolitografia, os processos podem ser realizados fora de uma sala limpa ou capuz limpo, no entanto, poeiras e partículas deve ainda ser minimizada para alcançar resultados consistentes.
- Conceber um padrão de micro-canais, como mostrado na Figura 1 em AutoCAD (AutoDesk Inc.). Empregar um fabricante terceiro (Fineline Imaging Inc.) para imprimir uma alta resolução (50.000 dpi) transmáscara de transparência em filme Mylar ou de quartzo, onde os canais são transparentes sobre um fundo escuro.
- Criar um silício e SU-8 mestre fotorresiste para a moldagem de réplica. Resumidamente, girar SU-8 2050 (Microchem) fotorresiste negativo com rpm recomendado pelo fabricante sobre um spin-coater para criar uma camada de 52 mM de espessura em uma superfície limpa de 7,5 cm ou 10 wafer de silício cm. Depois de cozer macio, borda interna do cordão de, exposição aos raios UV através de uma máscara de contato, pós-exposição cozer, desenvolvimento e exposição de inundação, medir a espessura real da camada SU-8 usando um perfilômetro Dektak (Veeco). Tape o molde mestre para o fundo de um 4 "ou 5" placa de Petri para preparar PDMS moldagem de réplica.
- Mix base de elastómero de PDMS com o agente de cura de elastómero (Dow Corning) em uma razão de 10:1 de base w / w para agente de cura. Verter bem misturada precursor PDMS para o mestre de silício para criar uma camada de espessura de 2-3 mm final. Uma mistura de 20 g de base de elastómero com 2 g do agente de cura é suficiente para cobrir uma superfície de diâmetro 4 ".
- Coloque a master molde e PDMS em exsicador de vácuo (Jencons) para o PDMS de-gás não curado. Usando um regulador de pressão (Cole Parmer), lentamente diminuir a pressão manométrica câmara de 0 "Hg para -27" Hg durante 20 minutos para evitar a excessiva formação de espuma. Deixar dispositivo na câmara de vácuo a -27 "Hg durante 30 minutos ou até que as bolhas de ar desaparecer.
- Libertação de vácuo e mover o molde mestre e PDMS para um forno de 65 ° C (Thermo Scientific) para um mínimo de quatro horas. O dispositivo pode ser deixado no forno durante a noite para melhorar a cura.
- Remova o dispositivo de forno e deixa-se arrefecer. Corte com cuidado em torno de PDMS wafer circular usando uma faca de precisão e casca fora PDMS. Cortar contorno dispositivo como mostrado na Figura 1 com um bisturi.
- Portas de perfurador fluídicos (três por dispositivo) nas três regiões redondos mostrados na Figura 1, usando um punção de biópsia. Para este dispositivo, usar um 0,75 milímetros de diâmetro exterior perfurador (Harris).
- Respeite fita adesiva para o lado modelado do PDMS e casca para remover qualquerpó. Como uma alternativa de redução de custos, mas viável para aparelhos de plasma convencionais de oxigênio, 21,22 plasma tratar o lado modelado do PDMS e um 3 limpa "x 1" lâmina de vidro usando um hand-held laboratório corona tratador (Electro-Technic Products Inc .) 23. Note-se que este dispositivo deve ser utilizado em um exaustor ou área bem ventilada devido à descarga de ozônio, e todos os relógios e telefones celulares devem ser mantidos pelo menos dez metros de distância. Ajustar a descarga de coroa para atingir uma coroa estável com o mínimo de faíscas. Lentamente acenar o eletrodo aproximadamente 1/4 "acima de cada superfície de cerca de 20 segundos e logo em seguida trazer as superfícies tratadas em contato para formar um forte vínculo permanente antes de as superfícies de PDMS retornar ao seu estado nativo.
- Coloque o dispositivo sobre uma placa de metal, lugar num forno de fresco, definir o forno a 120 ° C, e cozer durante a noite para completar a ligação e para retornar o PDMS ao seu estado hidrofóbico original. 24 Durante este fermento de alta temperatura, tele superfície de vidro do canal também ser processado hidrofóbico devido à deposição de uma camada hidrofóbica fina sobre o vidro. Alternativamente, os revestimentos hidrofóbicos tais como Aquapel (PPG Industries) pode ser injectado nas portas fluídicos usando uma seringa de 1 mL e uma agulha de seringa 12. Cuidadosamente, mas firmemente injectar a Aquapel seguido por purga de ar para as portas fluídicos sem quebrar o vínculo PDMS ao vidro . Agressivamente repetir a purga de ar em todas as portas de entrada e saída, enquanto limpando qualquer Aquapel excesso, a fim de evitar quaisquer depósitos que podem entupir os canais de secagem.
2. Preparação da Amostra
- Prepara-se uma cultura de células de acordo com procedimentos estabelecidos para o seu tipo de célula escolhido. Para o dispositivo particular usado neste estudo, 8-15 uM partículas ou células devem adequadamente requisitar para encapsulamento. Tipos de células menores ou maiores podem exigir alterar as dimensões do canal de focagem para alcançar p Re adequada. Para o meresultados de demonstração Thod mostrados neste trabalho, 9,9 mM de poliestireno microesferas (G1000, Thermo Scientific) são utilizados como substitutos das células.
- Preparar a partícula aquosa ou suspensão de células através de agitação suave. Quando se utiliza células ou partículas de poliestireno, o controlo de concentração é essencial (ver Figura 4) para alcançar o encapsulamento ordenados ideal. Usando os dados anteriores 12 como um guia, calcular a célula desejado ou concentração de partículas com base no espaçamento trem ordenada e tamanho do canal de micro-como: uma célula ou partícula por esperados vezes trem longitudinais de espaçamento a concentração de canal na área de corte transversal. Se a concentração de estoque (1% w / w) é inadequado, aumentar a concentração (aqui a 1,5% w / w) suavemente por centrifugação da amostra banco de remoção de líquido sobrenadante, e re-suspensão das partículas por vórtice de mistura, ou mais suave mistura quando se utiliza células. Preparar um volume adequado de conta para o volume desejado e recolha para o tempo de execução associado com flow sintonia.
- Ambas as células e partículas de poliestireno têm um peso específico maior do que um. Apesar de não ser demonstrado neste protocolo, a longo prazo experiências com uma duração da ordem de vários minutos a horas, a flutuabilidade coincidir com a solução pela adição de um soluto tal como CaCl 2 para partículas ou OptiPrep (Sigma-Aldrich) para as células.
- Prepara-se uma amostra de 10 mL da fase contínua de óleo de fluorocarbono por mistura do óleo de fluorocarbono FC-40 (3M) e PFPE-PEG bloco tensioactivo de copolímero 25 (2,5% w / w) (Raindance Technologies) em um tubo de centrífuga de 15 mL. Alternativamente, o óleo mineral leve (Chemicals Processo PTI) pode ser utilizado com ABIL-EM surfactante 90 (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).
3. Instalação Experimental
- Ligue o microscópio óptico invertido (Axio Observer, Zeiss) e câmera de alta velocidade (Phantom V310, Vision Research). Concentre-se e inspecionar os canais de tamancos e detritos por qualquer mover manualmente o dispositivo ouusando um microscópio de fase motorizado. Alguns fragmentos pequeno pode ser empurrado para fora quando o líquido flui através de. Para partículas grandes ou tamancos óbvias, selecione outro canal no dispositivo como detritos no canal de focagem pode degradar significativamente a qualidade ordenação. Note-se que obstruções pode muitas vezes ser removido sob fluxo pressionando firmemente na superfície PDMS acima da região afectada com uma pinça romba.
- Corte três pedaços de tubos de PVC (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) para a entrada aquoso, óleo de entrada e saída de emulsão. Para minimizar o volume morto, cortado apenas o suficiente para alcançar tubagem a partir das bombas de seringa para a platina do microscópio. Cortar as extremidades de tubos a um ângulo de 45 ° para facilitar a inserção em portos fluídicos.
- Use pinças para pressionar encaixar o tubo termina nas portas fluídicos perfurados no Passo 1 e pressione encaixar dois calibre 30 blunt-ponteira de aço inoxidável agulhas de seringa de aço (SmallParts) nas extremidades livres do aquosa respectivo e os tubos de alimentação de óleo (não necessário adesivo) . Colocar o tubo de saída para um r resíduoseservoir. Este tubo irá mais tarde ser movido para um reservatório de recolha.
- Mova o dispositivo ea tubulação em anexo ao estágio do microscópio, alinhar e focar o bico dispositivo usando um objetivo disponível (20x foi utilizado para este experimento). Ajustar para K hler iluminação e configurações microscópio outros, conforme necessário para uma excelente gravação.
- Encher uma seringa de 1 mL (BD) com a fase aquosa bem misturada e uma seringa de 3 ml (BD) com a solução de fase oleosa preparada no Passo 2. Observe que todas as seringas de qualquer volume pode ser usado e deve ser cuidadosamente selecionados em função dos tempos de execução desejados e minimização de qualquer pulsatilidade. Incline uma seringa na vertical e um ligeiro toque para mover as bolhas de ar à saída de seringa. Lentamente deprimir êmbolo suficiente para empurrar o ar para a ponta da seringa. Segurando a seringa na vertical, ligar as seringas para a agulha da seringa respectivo já ligado ao dispositivo no Passo 3,3. Deprimir êmbolo para forçar o ar através do volume morto agulha de seringa até que o fluido é pushed através da tubagem quase para o dispositivo. Firmemente montar a seringa a uma bomba de seringa (Nexus 3000, Chemyx) e envolver o bloco êmbolo. Repita as ligações para a segunda seringa e montar a uma bomba de seringa segundo.
- Potência em cada bomba de seringa e programa usando os protocolos do fabricante da bomba. Estabelecer as taxas de fluxo inicial de Q óleo = 50 uL / min e Q aq = 5 uL / min para a fase de óleo e fase aquosa, respectivamente. Iniciar as bombas.
- Espere para cada fluido para introduzir o dispositivo e preencher os canais, empurrando para fora o ar morto restante. Isso pode levar vários minutos. Se houver uma grande quantidade de ar na tubagem de entrada, aumentar temporariamente a cada taxa de fluxo até que o ar é expelido. Não aumente as taxas de fluxo tão alto que as pressões ocorrem grandes no canal, levando potencialmente a PDMS-para-vidro falha vínculo.
- Usando as taxas de fluxo inicial, observar a formação de gotas no bico (resultados mostrados aqui: 20x magnification, frame rate 21005 fps, exposição 3 mS). Reduzir o campo de vista da câmera para apenas o bocal para maximizar a taxa de frame e reduzir os requisitos de memória, se possível. Captura vídeos de amostra e confirmar que a taxa de amostragem é adequada para evitar aliasing.
- Para evitar a jacto (ver Figura 2), começar com baixas taxas de fluxo aquoso. Lentamente, aumentar a taxa de fluxo aquoso para observar ordenação de partículas no canal de solução aquosa de longo com o aumento da taxa de fluxo.
- Se a concentração de partículas é demasiado baixo para proporcionar comboios com relativamente poucos "em falta" partículas e da amostra não foi flutuabilidade encontrados, fisicamente inclinar a bomba de seringa para a saída da seringa para proporcionar gradual sedimentação de partículas para a saída de uma seringa. Este método é demonstrado no protocolo de vídeo. Periodicamente rotativo a seringa ao longo do seu eixo pode também reduzir a sedimentação indesejada.
- Uma vez ordenação adequada ocorre, ajustar a taxa de fluxo de óleo para sintonizar a frequência de geração etamanho de gotas. O volume da gota média pode ser calculado utilizando a taxa de fluxo aquoso dividido pela frequência geração gota como medido por captura de vídeo. Iterativamente ajustar as taxas de ambos os fluxos de atingir taxas de encapsulamento desejados e volumes de gota.
- Uma vez estável de encapsulação é confirmada ordenada, mover o tubo de saída a partir do reservatório de resíduos para um reservatório de recolha ou alimentá-lo em outro dispositivo para teste subsequente.
- Determinar o tempo de recolha com base no número desejado de gotículas e da frequência de geração calculada.
- Gravar a fracção de gotas contendo 0, 1, 2, ..., N partículas para quantificar a eficiência usando quer gota video resultados da produção ou por pipetagem de uma amostra de emulsão recolhidos para inspecção.
4. Os resultados representativos
Os resultados são apresentados que alcançar tanto controlada de partícula única e controlada de encapsulação de duplo de partícula (Figura 3). Ao cortara taxa de fluxo de FC-40 óleo em meia, uma única partícula de encapsulação torna-se dois-partícula de encapsulação. Por outro lado, poderíamos ter aumentado a taxa de fluxo aquoso para fornecer partículas para o bico mais rapidamente, mas também teria aumentado o risco de ejecção do fluxo aquoso. Histogramas da Figura 3 apresenta o número fraccionário de partículas por gota para os dois casos, juntamente com as comparações com estatística de Poisson. As gotas ocasionais com partículas de zero são principalmente devido à "faltando" partículas nos comboios ordenadas, enquanto que os casos em que existem partículas mais do que encapsulados resultado desejado a partir de locais altas concentrações de partículas e as partículas que, por vezes, migram para uma das duas posições verticais de focagem. Note-se que a flutuabilidade correspondente conforme descrito na Seção 2, não foi utilizado. Em vez disso, a bomba de seringa foi fisicamente inclinada para permitir sedimentação de partículas para a saída da seringa, levando a uma elevada concentração de partículas durante a corrida.
Uma execução experimental ilustra a necessidade de partícula adequada e as concentrações de células é mostrado na Figura 4. Sem ordenação completa, os grupos localizados de forma de partículas e são encapsulados, mas muitas gotas são sem partículas. Um histograma mostra a diminuição da eficiência de encapsulação para o encapsulamento de partícula desejado dois.
Figura 1. Dispositivo de encapsulamento. a) dispositivo geral com entradas, saída, e canal de ordenação muito tempo. A altura do dispositivo é de 52 mM ea largura do canal ordenação é de 27 mM. b) Tanto aquosa e as entradas de óleo têm filtros detritos grandes com aberturas do fim da largura do canal ordenar para o ponto de vista ampliada da entrada de óleo. c) A vista alargada do bico mostra larguras de canal iguais de 27 mm para os canais aquosos e óleo, seguido pela contracção do bocal de 22 uM e expansão súbita de um canal mais largo iM 61.Note-se que as dimensões do dispositivo mostrado aqui foram verificados utilizando um perfilómetro após microfabricação e diferem um pouco das dimensões nominais da máscara. A verdadeira imagem do canal de ordenação e bico estão disponíveis on-line como Suplementar Figura 1 . A máscara de arquivo AutoCAD também foi incluída on-line como um complemento a este manuscrito.
Figura 2. Histerese de um gotejamento para a transição de jacto usando um mais amplo do dispositivo (80 mM de largura x 22 uM alta). a) Para a taxa de FC-40 de fluxo constante (Q óleo = 45 uL / min), a formação de gota constante ocorre a 10 kHz utilizando uma solução aquosa caudal Q aq = 8 uL / min. Como a taxa de fluxo aquosa é lentamente aumentada para 10 e mu; L / min, ejecção do fluxo de fluido aquoso é disparado. b) Quando a taxa de fluxo é retornado a 8 mL / min de jacto continua. Note-se que a formação de gota constante pode ser re-estabelecido, por breves instantes parando a bomba de fluxo aquoso (uma pausa de 1 segundo é típico).
Figura 3. Encapsulação simples e dupla-partícula. Uma formação da gota) com uma célula por gota (Q óleo = 60 uL / min, Q aq = 9 mL / min) com uma taxa de geração de gota de 6,1 kHz, o tamanho médio de gota 24,4 pL, e uma eficiência de captura de uma única célula D k = 79,5% e P k = 83,7% (λ = 0,95) para um tamanho de amostra de n d = 517 gotas e n p = 491 partículas formação da gota. b) com duas células por gota é conseguido simplesmente por redução da FC-40 caudal de óleo Q para 30 μL / min. As maiores (39,8 pL) gotas são formados a uma taxa de 3,8 kHz com uma eficiência de captura de duas células D k = 71,5% e P k = 79,5% (λ = 1,80) para um tamanho de amostra de n D = 383 gotas e n p = 689 partículas. CD) Dois histogramas comparar as eficiências de encapsulação de queda de partículas de D k ordenou encapsulamento simples e duplo de partículas, com estatística de Poisson (encapsulamento aleatório). Note-se que para ambos os casos, o espaçamento de partícula na direcção do fluxo é de cerca de 17-18 mm para totalmente ordenadas, as partículas alternados. Vídeos Suplementares mostrando tanto o encapsulamento de um único e duplo-partícula estão disponíveis online. Clique aqui para ver 3 filmes complementares . Clique aqui para ver 3b filme Suplementares .
Concentração Figura 4. Afecta grandemente a eficiência de encapsulamento. A) Como as reduções de concentração, ordenação completa não ocorre, e assim "buracos" nos trens emergir, deixando algumas gotas com menos do que as partículas previstas. B) O histograma mostra a eficiência diminuiu ( D k = 55,9%, P k = 70,9%) para dois-partícula de encapsulação devido a um valor mais baixo de λ = 1,57, onde há quase a mesma quantidade de partículas de um único cai como existem duas vezes de partículas gotas. Isto resulta a partir de óleo figura Q = 30 uL / min e Q aq = 9 mL / min, as condições de escoamento mesmas para Figura 3b. Um vídeo representante suplementar está disponível online. Clique aqui para ver 4 Movie Suplementar .
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Discussão
Apesar graus relativamente elevados de ordenação, nem todos os gotas conterá o número apropriado de partículas ou células. Eficiência de encapsulação pode ser calculada como o número de células ou partículas que ficam encapsulados em gotas com a ocupação desejado dividido pelo seu número total. Estes dados em bruto pode ser obtido quer a partir de um algoritmo de vídeo de alta velocidade automático ou de imagiologia de uma amostra de emulsão recolhida. Isto pode ser comparado com a fracção de partículas de ...
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Divulgações
JE é um inventor em uma patente pendente baseado na tecnologia utilizada neste manuscrito.
Agradecimentos
Agradecemos Technologies Raindance para a amostra de PFPE-PEG surfactante utilizada neste estudo, e agradecemos a BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, diretor) para o molde de wafer de silício usado para criar réplicas dos canais de PDMS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| AutoCAD | AutoDesk | ||
| Máscara de transparência | Fineline Imaging Inc. | ||
| SU-8 Photoresist | Microchem | 2050 | |
| Profilometer Dektak | Veeco | ||
| Placa de Petri | BD Falcon | 351058 | |
| PDMS Kit Elastômero de Silicone | A Dow Corning Corp | Sylgard 184, número de material (240) 4019862 | |
| Exsicador de vácuo | Jencons | 250-030 | |
| Bomba de vácuo | Alcatel Vacuum Technology | 2010 C2 | |
| Regulador de vácuo | Cole-Parmer | EW-00910-10 | |
| Forno | Thermo Scientific | Lindberg Blue M, OV800F | |
| Biópsia com punch, 0,75 mm | Harris | Uni-Core 15072 | |
| Laboratório de Corona Treater | Electro-Technic Products Inc. | BD-20AC, SKU 12051A | |
| Lâminas de vidro | Gold Seal | 3010 | |
| Aquapel | PPG Industries | Estratégia Alternativa | |
| Microesferas de poliestireno, 9,9 mM | Thermo | G1000 | |
| OptiPrep | Sigma-Aldrich | D1556 | Não demonstraram |
| Luer-Lok Seringas | BD | 1 mL: 309,628 3 mL: 309,585 | |
| FC-40 Óleo Fluorocarbon | 3M Inc. | Sigma Aldrich, F9755 | |
| PFPE-PEG fluorotensioactivo | Raindance Technologies | ||
| Óleo Mineral Luz | Processos Químicos PTI | 08042-47-5 | Estratégia Alternativa |
| Surfactante Óleo Mineral | Evonik Goldschmidt Corporação | ABIL EM 90 | Estratégia Alternativa |
| Tygon Tubing PVC | SmallParts | TGY-010 | |
| Calibre 30 Luer-Lok Seringa Agulha, 1/2 " | SmallParts | NE-301PL-C | |
| Microscópio invertido | Carl Zeiss imagem | Axio Observer.Z1 | |
| Câmera de alta velocidade | Vision Research | Fantasma V310 | |
| Bombas de seringa (2) | Chemyx Inc. | Nexus 3000 | |
| Óleo de silicone | A Dow Corning | 200 de fluido, a 10 cSt | Opcional para armazenamento de emulsão |
Referências
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