Artigo de método

Câncer de modelagem Colite Associada com Azoximetano (OMA) e sulfato de sódio Dextran (DSS)

DOI:

10.3791/4100

⸱

11 de setembro de 2012

 ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Washington University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós demonstramos um protocolo em que a administração do agente genotóxico azoximetano (AOM), seguido por três ciclos da pró-inflamatória de sódio sulfato de agente de dextrano (DSS) de forma rápida e consistentemente gera tumores do cólon em ratos com semelhanças morfológicas e moleculares para as observadas em humanos colite Associadas cancro.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os indivíduos com a doença inflamatória do intestino (IBD), como a doença de Crohn (DC) ou a colite ulcerosa (UC) estão em risco aumentado de desenvolver cancro colo-rectal (CRC) nos indivíduos saudáveis. Este risco é proporcional à duração e à extensão da doença, com incidência cumulativa tão alta quanto 30% em indivíduos com UC de longa data com envolvimento do cólon generalizada. Uma displasia colônica em IBD e colite associada a câncer (CAC) Acredita-se que desenvolver como resultado de ciclos repetidos de lesão e reparação de células epiteliais, enquanto estas células são banhadas em meio de citocina inflamatória crónica. 2 Enquanto cancros espontâneos e colite associada a partilhar a qualidade de adenocarcinomas sendo, a sequência de eventos moleculares subjacentes acredita-se ser diferente. 3 Este distinção argumenta a necessidade de modelos animais específicos do CAC.

Modelos de ratos Existem actualmente vários para o estudo da CAC. Sulfato de dextrano sodihm (DSS), um agente com efeitos tóxicos directos sobre o epitélio do cólon, podem ser administrados na água de beber para ratos em vários ciclos para criar um estado inflamatório crónico. Com duração suficiente, alguns destes ratos desenvolvem tumores. 4 O desenvolvimento do tumor é acelerada, neste modelo, se administrado em um ambiente pró-carcinogénicos. Estes incluem os ratos com mutações genéticas em tumorigénese vias (APC, p53, Msh2), bem como ratinhos pré-tratados com agentes genotóxicos (azoximetano [OMA], 1,2-dimetil-hidrazina [DMH]) 5.

A combinação de DSS com OMA como um modelo para a colite câncer associado ganhou popularidade por sua reprodutibilidade, potência, preço baixo e facilidade de uso. Embora eles têm um mecanismo comum, AOM foi encontrada para ser mais potentes e estáveis ​​em solução do que DMH. Embora o desenvolvimento de tumores em outros modelos requer geralmente de vários meses, camundongos injetados com AOM e subsequentemente tratados com DSS desenvolver tumores adequadas numas pouco como 7-10 semanas. 6, 7 Finalmente, AOM e DSS podem ser administrados a ratos de todo o fundo genético (knock out, transgénicos, etc), sem cruzamento de uma linhagem tumorigénico específico. Aqui, demonstramos um protocolo para a inflamação orientada tumorigénese do cólon em ratos, utilizando uma única injecção de AOM seguido por três ciclos de sete dias de DSS durante um período de 10 semanas. Este modelo induz tumores com alterações histológicas e moleculares muito semelhantes às que ocorrem em CAC humana e proporciona um modelo altamente valiosa para o estudo da quimioprevenção oncogénese e na doença. 8

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Colite associada a indução de cancro

  1. Separe gaiolas de sexo e de mesma faixa etária 6-8 ratos semanas de idade para ser usado para grupos experimental e controle. Ratos podem ser individualmente rotulado com marcações da cauda ou clipes de ouvido.
  2. No dia 0, os pesos de base de registo e injectar por via intraperitoneal a cada rato (IP) com 10 mg / kg de AOM solução de trabalho (1 mg / ml em solução salina isotónica, diluída a partir de 10 mg / ml de solução concentrada em dH2O mantida a -20 ° C) . Com base na experiência, esta dose pode ser ajustado entre 7-14 mg / kg e / ou repetida no início da experiência.

Atenção: OMA é um agente volátil genotóxico e devem ser manuseados com cuidado de acordo com a MSDS acompanha. As diluições devem ser preparadas de um capuz químico, mantidos em gelo, e descartada seguindo protocolos específicos instituição.

  1. Fazer a 2,5% (2,5 g/100 ml) solução DSS em água destilada e passa através de um 0,22 mM de acetato de celulose filter por vácuo. Esta dose pode ser ajustada entre 1-3,5%, dependendo da estirpe de ratinho e de ambiente. Uma vez preparada uma solução, DSS pode ser mantido refrigerado durante até 1 semana.
  2. No dia 7, solução de abastecimento DSS para ratos como sua água potável. Cerca de 250 ml / gaiola será necessária cada vez DSS novo é fornecido para um máximo de 5 murganhos / gaiola, no entanto, estes são apenas estimativas e irá variar dependendo do tipo de garrafas de água usadas na sua instalação para animais.
  3. Para garantir um suprimento contínuo de DSS por sete dias, a solução DSS deve ser substituído em garrafas limpas três vezes (a cada 2-3 dias) durante esse período. Alguns investigadores medir a quantidade de DSS consumidos antes da substituição com a solução de novo como uma medida da exposição.
  4. No dia 14, comutar gaiolas de volta à água potável normal durante duas semanas.
  5. Repita os passos (1.4) - (1.6), nos dias 28 e 49 para proporcionar um segundo e terceiro ciclos de DSS. Um "ciclo" DSS consiste de uma semana de DSS na água potávelseguido de 2 semanas de água (autoclavado) regular.

2. Colite Avaliação clínica e progressão do tumor

  1. Ratos deve ser pesado / observados 2-3 vezes por semana. Perda por cento em peso em relação à linha de base é utilizado como uma medida substituta da severidade da colite. Avaliações regulares de sangramento retal, diarréia, ou prolapso podem ser feitas dependendo objetivos experimentais e relatados de acordo com vários sistemas de pontuação. 9, 10
  2. Uma perda de peso de até 10%, juntamente com 2-3 dias de diarreia e sangramento rectal pode ser esperado na semana após um ciclo completo de DSS (observação diária pode ser útil durante este período de pós-DSS imediata).

É possível que alguns ratos não podem recuperar; ratinhos perdem mais de 20% do seu peso é menos provável que sobrevivem e podem exigir a eutanásia precoce. Uma injeção de IP único de 0,5-1,0 ml de solução salina em camundongos tais pode ser uma medida útil de apoio para corrigir flui o volume d perdido devido à diarreia.

3. Murino Endoscopia (Opcional)

  1. Endoscopy seguindo o ciclo de segunda ou terceira de DSS podem ser realizados para confirmar o crescimento do tumor in vivo antes do sacrifício. Como o AOM / modelo DSS é bastante confiável na produção de tumores, este passo não é geralmente necessário. Apenas alguns ratos deve avaliadas utilizando este método, uma vez que tem o potencial para destruir tumores de ratos 11.
  2. Anestesiar o rato com sedação inalatória ou injetável.
  3. Depois de mouse é anestesiado, garantir o mouse para uma tábua plana com fita na cauda e no peito.
  4. Avançar o endoscópio murino no reto do rato delicadamente com soro fisiológico para inflar e irrigar a melhorar a visão intraluminal e remover conteúdo fecal. (Note-se que a endoscopia também pode ser realizada usando insuflação de ar, como uma alternativa à solução salina e esta técnica pode oferecer visualização melhorada do tumor 12.)
e "Sacrifice> 4. Rato e colheita Colon
  1. No dia 70, cada rato OMA / DSS tratada deve abrigar vários tumores de cólon e estar pronto para a avaliação. Esta data pode ser adiada semanas a meses se tumores maiores são desejados. (De notar que os ratos com grave prolapso rectal podem ter de ser sacrificados antes para evitar desconforto excessivo para animais de acordo com as comissões institucionais de cuidados com animais.)
  2. Antes de necropsia, individualmente eutanásia ratos com luxação isoflurano e cervical (ou método institucionalmente aprovado outro). Peso final e outras medições podem ser feitas neste momento.
  3. Coloque o mouse com o lado ventral exposto em uma placa de corte. Cobrir o abdómen com etanol a 70% para evitar a contaminação de cabelos de os conteúdos abdominais durante a extracção do cólon.
  4. Use uma pinça para agarrar a linha média do abdome e fazer uma pequena incisão para expor o peritônio.
  5. Estender esta incisão em cada lado do abdómen ao longo da margi costaln.
  6. Utilize uma tesoura para cortar através da pélvis de modo a que o cólon pode ser colhido para baixo para a junção anorretal. Isto é importante porque DSS lesão colite é maior no recto distal e, correspondentemente, esta é a região de maior desenvolvimento do tumor.
  7. Outros tecidos, tais como os nódulos linfáticos mesentéricos também podem ser colhidas no momento.

5. Preparando o Colon para análise macroscópica

  1. Utilizando uma agulha de gavagem 18G ligada a uma seringa de 5 ml, lavar o cólon com gelado salina tamponada com fosfato (PBS), de tal modo que as saídas de fluido na direcção fisiológico. Se o tecido de cólon será usado para RNA ou proteína baseada em análise, pode ser mantido frio, empregando tabuleiros pré-resfriada trabalho.
  2. Abra o cólon corado longitudinalmente ao longo de seu mesentério e pintura na bandeja frio. Os tumores são mais facilmente visualizados quando o cólon é colocado sobre uma superfície escura. Alternativamente, a 1% de corante azul Alcian pode ser aplicado para realçar tumors. Avaliar o número e tamanho do tumor com uma régua ou paquímetro digital.
  3. Pequenas secções de tumor e tecido normal adjacente pode ser excisado, neste ponto para análise posterior por RNA, proteína, ou imunohistoquímicos (IHC) métodos, permitindo que uma parte do cólon remanescente para a avaliação histológica.

A fotografia digital das amostras brutas de cólon imediatamente após a etapa 5.2 pode ser útil para a análise precisa da carga de tumor, especialmente se porções significativas dos cólons são excisadas por outras formas de análise, tal como descrito acima. Carga tumoral (%) pode ser calculado como área de tumor / área total de cólon usando software livre, como o ImageJ.

6. Preparando o Colon para avaliação histológica

  1. Aplicar formalina a 10% para o cólon remanescente na bandeja frio por meio de seringa ou do dedo. Permitindo que o tecido para fixar, pelo menos, 30 s deste modo facilita a transferência para a bacia de fixação. Certifique-se de formalina residual é wiped fora antes da pintura um cólon novo, inaugurado na mesma bandeja.
  2. Transferir pontos para uma bacia cheia de formalina a 10% e fechar nas bordas.
  3. Depois de 3 horas de fixação, para transferir dois pontos de etanol a 70%. Cólons pode ser preservada em etanol a 70%, por tempo indeterminado.
  4. Três secções longitudinais de dois pontos (proximal, médio, distal / reto) pode ser estabilizado em ágar 2% e submetidos para inclusão em parafina. Assegurar que o cólon proximal e distal do cólon / recto são orientados de uma maneira uniforme para cada rato.
  5. Displasia, dano da cripta, e inflamação podem ser descritos e avaliados por uma pessoa experiente de acordo com protocolos anteriormente publicados. 10, 13-15 ratos podem ser sacrificados antes do dia 70, se o experimentador está interessado na detecção de eventos precoces displásicas.

7. Resultados representativos

O modelo OMA / DSS aqui descrito permite ao pesquisador confiável gerar tumores de cólon em camundongos.O crescimento do tumor neste modelo é directamente influenciada pelo processo inflamatório associado. Gravidade da colite devem ser monitorizados clinicamente por perda de peso e depois a presença de diarreia / hematoquezia (Figura 2). Estes sinais de actividade da doença tende a começar no dia 5 do ciclo de DSS e por quatro ou mais dias após o DSS é removido. Raramente, os ratos com uma carga significativa do tumor retal pode desenvolver prolapso retal. Após o ciclo de diarreia segundo ou terceiro DSS pode tornar-se persistente. Tipicamente os tumores estão presentes e identificáveis ​​por colonoscopia murino antes do terceiro ciclo de DSS (figura 3). Tempo adicional e um terceiro prato de resultados DSS em tumores maiores no momento da colheita (Figura 4). Uso de aplicação tópica Alcian blue mancha pode ser usada para destacar tumores (Figura 5). Fotografias de tumores de cólon vai ajudar a gerar medições de tumor que podem ser utilizados para comparar quantitativamente produção tumor e tamanhoentre os grupos experimentais (Figura 6). Fixos e parafina espécimes embebidos cólon pode então ser avaliada por histologia ou com a utilização de coloração imuno-histoquímica (Figura 7 e 8).

figure-protocol-1
Figura 1. Esquema de OMA e administração DSS. AOM (10 mg / kg) é injectado no dia 0. No início da segunda semana (7 dias), com solução 2,5% de DSS é administrada a ratos na sua água de beber. Sete dias de DSS é seguida por duas semanas de água autoclavada. Um adicional de dois ciclos de DSS são administrados antes do sacrifício.

figure-protocol-2
Figura de peso do rato 2. Relação à linha de base durante OMA e administração DSS. Note-se que na semana seguinte a cada ciclo de DSS, ratos los e 5-10% do seu peso corporal. A perda de peso neste experimento é um marcador para a gravidade da colite.

figure-protocol-3
Figura 3. Ver de tumores no cólon distal por meio de endoscopia murino do dia 50 de OMA / DSS tratamento. Observe as múltiplas massas polipóides obstruindo o lúmen do cólon distai (b, c) em relação ao cólon normal (a).

figure-protocol-4
Figura 4. Aberto longitudinalmente cólon do rato ilustrando aparência bruta de tumores. Note-se a mais elevada carga tumoral no cólon distai / recto (imagem superior esquerda), e a textura característica rugated do cólon proximal (imagem superior direita) com o crescimento do tumor pouco. Um fim acima da vista do cólon distal mostra inúmeros tumores de tamanhos variados (abaixo).

"fo: manter-together.within-page =" ove_content sempre "> figure-protocol-5
Figura 5. Tumores destacados pela aplicação de Alcian mancha azul. Note-se como o corante enfatiza a textura normal do cólon, bem como as fronteiras de cada tumor individual. Essa coloração pode ser útil na medição precisa de áreas de tumor por régua ou medida digital.

figure-protocol-6
Figura 6. Representante distribuição do número médio de tumores por rato tratados com AOM / DSS. Note-se a maioria dos tumores são localizados no cólon distai e são <2 mm de tamanho.

figure-protocol-7
Figura 7. Secções embebidas em parafina longitudinais do cólon em cassete (acima), umd no slide seguinte H & E mancha (abaixo). Note-se que Alcian azul residual mancha não interfere com H & E de coloração. Um grande tumor está circulado na imagem do slide (círculo). As designações "distal", "média" e "resultado" proximal de seccionamento todo o cólon em terços, entre o ceco eo ânus.

figure-protocol-8
Figura 8. Histologia representativas de um tumor resultante do AOM / DSS administração no cólon distai. H & E, BrdU, e β-catenina lâminas coradas em 50X (painel superior) e 400X (painel inferior), respectivamente, demonstram alterações displásicas semelhantes a adenocarcinomas humanos do cólon.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O tratamento de ratos com AOM e DSS rapidamente e eficazmente modelos colite associada a cancro humano. Hipóteses sobre hereditárias factores que contribuem para a colite cancros associados pode ser facilmente estudado em ratos geneticamente modificados. 13, 16 Alternativamente, o efeito de alvos farmacológicos de colite associada a cancro pode ser estudada utilizando ratinhos de tipo selvagem.

Embora este modelo é altamente valorizado por aqueles interessados ​​no estudo do desen...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado em parte por DK089016 e L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS), e P30-DK52574 (para a Universidade Central Washington Research Digestivo Doenças). AIT era uma Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow Formação.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
Ratos C57BL/6J Jackson Laboratory 000664
Azoximetano (OMA) Sigma Aldrich A5486-100mg Solução stock: diluído a 10 mg / ml em água destilada para ser mantido à temperatura de -20 ° C, tal como 0,5-1 ul.
Solução de trabalho: Diluir estoque de 1 mg / ml em isotónica (0,9%), solução salina
Dextran sulfato de sódio (DSS) Consultoria TdB DB001 MW 40 kDa (36-50 kDa preparados a partir de outras fontes, são aceitáveis; O mesmo lote deve ser usado para uma única experiência) 6
Coloviewsistema miniendoscopic Karl Storz Múltiplo Veja Becker et al. Uma explicação detalhada de equipamentos e instalação. 11
TPP rápida FilterMax 500 ml Frasco Filtrar, 0,22 PES Centro-Oeste Científico TP99500 Qualquer filtro de tecido de cultura padrão é aceitável
Álcool Etílico 200 Prova ASC / USP Fármaco-AAPER (ou outro) 11ACS200 Diluir a 70% em água destilada
USP, isoflurano Butler Abastecimento Saúde Animal 4029405 Coloque o rato em frasco de vidro com gaze ou um pequeno pano embebido em anestésico
18G agulha Gavage Braintree Científica N-008
Tampão fosfato salino (PBS) SigmaAldrich P5493 Diluir a 1X (0,01 M) em água destilada
Bandeja frio (Tissue Tek Plate II Fria) Fisher Scientific NC9491941 Armazenar a -20 ° C
ImageJ Software NIH (download gratuito) http://rsbweb.nih.gov/ij/
Formaldeído (37%) Fisher Scientific F79-500 Diluir a 10% em PBS
BD Bacto Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Use hotplate para criar uma solução a 2% em água destilada
Molho Miltex Fórceps Eye MedPlus Inc. 18-780
Olho Tesoura Miltex MedPlus Inc. 18-1430 pontos curvos evitar danos ao cólon durante a abertura.
Alcian Blue 8GX (pó) Sigma Aldrich A5268 Adicionar 1 g de pó em 100 ml de ácido acético a 3% (3 ml de ácido acético glacial + 97 ml de água destilada)
1 ml seringa de tuberculina com anexo 26 G x 3/8 em bisel da agulha intradérmica BD 305946 Para a injecção de OMA

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ekbom, A. Ulcerative colitis and colorectal cancer. A population-based study. N. Engl. J. Med. 323, 1228-1233 (1990).
  2. Terzic, J. Inflammation and colon cancer. Gastroenterology. 138, 2101-2114 (2010).
  3. Ullman, T. A., Itzkowitz, S. H. Intestinal inflammation and cancer. Gastroenterology. 140, 1807-1816 (2011).
  4. Okayasu, I. Dysplasia and carcinoma development in a repeated dextran sulfate sodium-induced colitis model. J. Gastroenterol. Hepatol. 17, 1078-1083 (2002).
  5. Kanneganti, M., Mino-Kenudson, M., Mizoguchi, E. Animal models of colitis-associated carcinogenesis. J. Biomed. Biotechnol. 342637, (2011).
  6. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat. Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
  7. Tanaka, T. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94, 965-973 (2003).
  8. De Robertis, M. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J. Carcinog. 10, 9(2011).
  9. Wirtz, S. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
  10. Cooper, H. S. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest. 69, 238-249 (1993).
  11. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat. Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
  12. Becker, C., Fantini, M. C., Wirtz, S., Nikolaev, A., Kiesslich, R., Lehr, H. A., Galle, P. R., Neurath, M. F. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
  13. Shaker, A. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. J. Clin. Invest. 120, 2081-2093 (2010).
  14. Boivin, G. P. Pathology of mouse models of intestinal cancer: consensus report and recommendations. Gastroenterology. 124, 762-777 (2003).
  15. Cooper, H. S. Dysplasia and cancer in the dextran sulfate sodium mouse colitis model. Relevance to colitis-associated neoplasia in the human: a study of histopathology, B-catenin and p53 expression and the role of inflammation. Carcinogenesis. 21, 757-768 (2000).
  16. Yoshida, Y. The forkhead box M1 transcription factor contributes to the development and growth of mouse colorectal cancer. Gastroenterology. 132, 1420-1431 (2007).
  17. Suzuki, R. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27, 162-169 (2006).
  18. Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, 544-551 (1998).
  19. Nambiar, P. R. Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors. Int. J. Oncol. 22, 145-150 (2003).
  20. Tanaka, T. Colorectal carcinogenesis: Review of human and experimental animal studies. J Carcinog. 8, (2009).
  21. Ciorba, M. A. Induction of IDO-1 by immunostimulatory DNA limits severity of experimental colitis. J. Immunol. 184, 3907-3916 (2010).
  22. Kerr, T. A. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: A poly-A purification solution. Inflamm. Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
  23. Tang, Y. is required for resection-induced changes in apoptosis, proliferation, and members of the extrinsic cell death pathways. Gastroenterology. 126, 220-230 (2004).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Modelo de Tumor em CamundongosIndu o de Tumor Col nicoAn lise Histol gicaAvalia o Endosc picaMedi o de TumorFixa o de TecidosInclus o em gar

Artigos relacionados