Amostragem Peptidome saliva humana Indígena Usando uma sonda de Ultrafiltração Lollipop-Like: simplificar e melhorar a detecção Peptide de Espectrometria de Massa Clínica

Resumo

Considerando coleta de saliva para uma futura aplicação clínica, um pirulito, como ultrafiltração sonda (LLUF) foi fabricada para caber na cavidade bucal humana. Análise directa da saliva não digerido por espectrometria de massa nanoLC-LTQ demonstraram a capacidade das sondas de LLUF para remover as proteínas grandes e proteínas de abundância elevadas, e fazer de baixa abundantes péptidos mais detectável.

Resumo

Embora humano saliva proteoma e peptidome foram revelados ^1-2 foram identificadas a partir majorly tríptica digere de proteínas salivares. Identificação de peptidome indígena da saliva humana, sem digestão prévia com enzimas exógenas torna-se imperativo, pois peptídeos nativas na saliva humana fornecer valores potenciais para diagnosticar a doença, prevendo a progressão da doença e monitorar a eficácia terapêutica. Amostragem adequada é um passo crítico para a melhoria da identificação de peptidome saliva humana indígena. Os métodos tradicionais de amostragem saliva humana envolvendo centrifugação para remover detritos ^3-4 pode ser demasiado morosos para ser aplicável para utilização clínica. Além disso, a remoção detritos por centrifugação pode ser incapaz de limpar a maioria dos agentes patogénicos infectados e remover as proteínas de abundância elevados que muitas vezes impedir a identificação de peptidome baixa abundância.

Convencionais abordagens proteômicas que prielectroforese em gel palmente utilizar bidimensional (2-DE) géis em conjugação com, em gel de digestão são capazes de identificar proteínas da saliva muitas ^5-6. No entanto, esta abordagem não é geralmente suficientemente sensível para detectar péptidos baixa abundância / proteínas. Cromatografia líquida de-espectrometria de massa (LC-MS) proteômica base é uma alternativa que pode identificar proteínas sem separação 2-DE prévio. Embora esta abordagem proporciona uma maior sensibilidade, geralmente necessita de amostra antes do fraccionamento de ^pré-7 e pré-digestão com tripsina, o que torna difícil para o uso clínico.

Para contornar o obstáculo em espectrometria de massa, devido à preparação da amostra, temos desenvolvido uma técnica chamada de ultrafiltração capilar (CUF) sondas de ^8-11. Dados do nosso laboratório demonstraram que as sondas CUF são capazes de captar proteínas in vivo a partir de vários microambientes em animais de uma maneira dinâmica e minimamente invasiva ^{8 -}11. N centrifugação é necessária uma vez que uma pressão negativa é criado por simplesmente retirada da seringa durante a recolha da amostra. As sondas CUF combinados com LC-MS foram identificados com sucesso proteínas tríptica-digeridos ^8-11. Neste estudo, nós atualizamos a técnica de amostragem de ultrafiltração através da criação de um pirulito, como ultrafiltração sonda (LLUF) que pode facilmente caber na cavidade bucal humana. A análise directa por LC-MS sem digestão com tripsina revelaram que a saliva humana indigenoso contém muitos fragmentos peptídicos derivados de várias proteínas. Coleta de saliva com sondas LLUF evitado centrifugação, mas efetivamente removido muitas proteínas maiores abundância e alta. Nossos resultados de espectrometria de massa mostrou que muitos peptídeos baixa abundância tornou-se detectável após filtrar proteínas maiores com sondas LLUF. Detecção de peptídeos de saliva de baixo custo de abundância foi independente da múltipla passo de separação da amostra com a cromatografia. Para aplicação clínica, as sondas LLUF incorporard com LC-MS pode potencialmente ser usado no futuro para monitorar a progressão da doença a partir de saliva.

Protocolo

1. Criação de Sondas LLUF

1. As membranas polietersulfona (2 cm ²⁾ foram selados com pás de polipropileno triângulo (University of California, San Diego) por membranas de colagem com epóxi sobre as fronteiras de pás. Uma membrana de polietersulfona carregado negativamente com um peso molecular de corte-(MWCO) de 30 kDa foi usado.
2. Um tubo de teflon propileno fluorado de etileno (diâmetro interno / diâmetro exterior, 0.35/0.50 cm) foi ligado a uma saída de cilindro de um pá de polipropileno triângulo de modo a sonda LLUF pode ser ligado a uma seringa de 20 ml.
3. Após a imersão da membrana de polietersulfona em saliva humana em um pr....

Discussão

Verificou-se que existem muitos fragmentos peptídicos na saliva não digerido humano. Estes fragmentos peptidicos são derivados a partir de várias formas de prolina proteínas ricas, actina, alfa amilase, alfa globina 1, beta-globina, histain 1, queratina 1, mucina 7, receptor de imunoglobulina polimérica, satherin, S100A9. Poderia haver muitos factores que contribuem para a produção de péptidos com sítios de clivagem indeterminadas. Por exemplo, alguns fragmentos peptídicos podem ser naturalmente presente na saliva human.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
Membranas polietersulfona	Pall Corporation		30 kDa MWCO
Teflon tubo de propileno fluorado etileno	Upchurch Científico
Azul dextrano	Sigma
Nano LC sistema	Eksigent
Coluna armadilha C18	Agilent	5065-9913
LTQ linear espectrômetro de massa ion trap-	Thermo Fisher
Sorcerer 2	Sage-N ReseaRCH
-Acetonitrilo a 0,1% de ácido fórmico	JT Baker	9832-03	LC / MS grau
-Água 0,1% de ácido fórmico	JT Baker	9834-03	LC / MS grau