Artigo de método

Amostragem Peptidome saliva humana Indígena Usando uma sonda de Ultrafiltração Lollipop-Like: simplificar e melhorar a detecção Peptide de Espectrometria de Massa Clínica

DOI:

10.3791/4108

⸱

7 de agosto de 2012

 ,  , 
1Sanford-Burnham Medical Research Institute, 2Division of Dermatology, University of California, San Diego , 3VA San Diego Healthcare Center, 4Moores Cancer Center, University of California, San Diego

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Considerando coleta de saliva para uma futura aplicação clínica, um pirulito, como ultrafiltração sonda (LLUF) foi fabricada para caber na cavidade bucal humana. Análise directa da saliva não digerido por espectrometria de massa nanoLC-LTQ demonstraram a capacidade das sondas de LLUF para remover as proteínas grandes e proteínas de abundância elevadas, e fazer de baixa abundantes péptidos mais detectável.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embora humano saliva proteoma e peptidome foram revelados 1-2 foram identificadas a partir majorly tríptica digere de proteínas salivares. Identificação de peptidome indígena da saliva humana, sem digestão prévia com enzimas exógenas torna-se imperativo, pois peptídeos nativas na saliva humana fornecer valores potenciais para diagnosticar a doença, prevendo a progressão da doença e monitorar a eficácia terapêutica. Amostragem adequada é um passo crítico para a melhoria da identificação de peptidome saliva humana indígena. Os métodos tradicionais de amostragem saliva humana envolvendo centrifugação para remover detritos 3-4 pode ser demasiado morosos para ser aplicável para utilização clínica. Além disso, a remoção detritos por centrifugação pode ser incapaz de limpar a maioria dos agentes patogénicos infectados e remover as proteínas de abundância elevados que muitas vezes impedir a identificação de peptidome baixa abundância.

Convencionais abordagens proteômicas que prielectroforese em gel palmente utilizar bidimensional (2-DE) géis em conjugação com, em gel de digestão são capazes de identificar proteínas da saliva muitas 5-6. No entanto, esta abordagem não é geralmente suficientemente sensível para detectar péptidos baixa abundância / proteínas. Cromatografia líquida de-espectrometria de massa (LC-MS) proteômica base é uma alternativa que pode identificar proteínas sem separação 2-DE prévio. Embora esta abordagem proporciona uma maior sensibilidade, geralmente necessita de amostra antes do fraccionamento de pré-7 e pré-digestão com tripsina, o que torna difícil para o uso clínico.

Para contornar o obstáculo em espectrometria de massa, devido à preparação da amostra, temos desenvolvido uma técnica chamada de ultrafiltração capilar (CUF) sondas de 8-11. Dados do nosso laboratório demonstraram que as sondas CUF são capazes de captar proteínas in vivo a partir de vários microambientes em animais de uma maneira dinâmica e minimamente invasiva 8 -11. N centrifugação é necessária uma vez que uma pressão negativa é criado por simplesmente retirada da seringa durante a recolha da amostra. As sondas CUF combinados com LC-MS foram identificados com sucesso proteínas tríptica-digeridos 8-11. Neste estudo, nós atualizamos a técnica de amostragem de ultrafiltração através da criação de um pirulito, como ultrafiltração sonda (LLUF) que pode facilmente caber na cavidade bucal humana. A análise directa por LC-MS sem digestão com tripsina revelaram que a saliva humana indigenoso contém muitos fragmentos peptídicos derivados de várias proteínas. Coleta de saliva com sondas LLUF evitado centrifugação, mas efetivamente removido muitas proteínas maiores abundância e alta. Nossos resultados de espectrometria de massa mostrou que muitos peptídeos baixa abundância tornou-se detectável após filtrar proteínas maiores com sondas LLUF. Detecção de peptídeos de saliva de baixo custo de abundância foi independente da múltipla passo de separação da amostra com a cromatografia. Para aplicação clínica, as sondas LLUF incorporard com LC-MS pode potencialmente ser usado no futuro para monitorar a progressão da doença a partir de saliva.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Criação de Sondas LLUF

  1. As membranas polietersulfona (2 cm 2) foram selados com pás de polipropileno triângulo (University of California, San Diego) por membranas de colagem com epóxi sobre as fronteiras de pás. Uma membrana de polietersulfona carregado negativamente com um peso molecular de corte-(MWCO) de 30 kDa foi usado.
  2. Um tubo de teflon propileno fluorado de etileno (diâmetro interno / diâmetro exterior, 0.35/0.50 cm) foi ligado a uma saída de cilindro de um pá de polipropileno triângulo de modo a sonda LLUF pode ser ligado a uma seringa de 20 ml.
  3. Após a imersão da membrana de polietersulfona em saliva humana em um prato de cultura (50 mm de diâmetro), a pressão negativa foi criado por retirada de uma seringa. A seringa com pressão negativa levou o processo de ultrafiltração para amostragem proteínas a partir de saliva.
  4. As sondas foram esterilizadas com álcool a 70% durante a noite antes de usar. Para demonstrar o fecho, o posicionamento de sondas LLUF em uma soluçãoção contendo azul de dextrano (50 mg / ml) com uma massa molecular média de 2.000 kDa durante 2 h. A ausência de azul de dextrano nas amostras recolhidas indicaram que há fugas desenvolvido durante a fabricação da sonda e amostragem.

2. Coleta de saliva

  1. Saliva total foi coletada a partir de três voluntários saudáveis ​​(dois machos e uma fêmea entre as idades 20 e 40) que não tomam medicamentos, sem sinais evidentes de 6 de gengivite ou cárie.
  2. Após lavagem da boca com água, as amostras de saliva foram recolhidos por cuspir, sem estimulação química, em um vaso arrefecida com gelo.
  3. Todas as amostras foram reunidas e mantidas em gelo durante o processo de colheita.
  4. Imediatamente após a coleta, saliva (200 ul) foi aplicado para a amostragem com sondas LLUF. A amostragem foi realizada em uma sala de 4 ° C.
  5. Proteínas da saliva (1,0 mg / mL), com ou sem LLUF coleção sonda foram diretamente submetidas a nano-LC massa sanálise pectrometry sem digestão tríptica. As concentrações de proteína foram determinadas usando um ensaio de proteína Bio Rad-12.

3. NanoLC-LTQ Análise MS

  1. As amostras de un-digeridos saliva (5 uL) foram carregados directamente para a coluna de armadilha do sistema Eksigent nanoLC pelo amostrador automático, utilizando 100% de tampão A. (2% de ácido fórmico acetonitrile/0.1%) O nanoLC foi on-line juntamente com um espectrômetro de massa Finnigan LTQ.
  2. Após carregamento da amostra e lavagem, a válvula foi ligado e um 500 nl / min gradiente linear foi entregue para a armadilha ea coluna de separação (10 cm de comprimento, 100 uM ID, in-house embalados com Synergi 4 mm de C18). O gradiente foi de 0 a 50% de tampão B (80% acetonitrile/0.1% de ácido fórmico) em 45 min.
  3. Os instrumentos nanoLC-LTQ MS foram operados no modo dependente dos dados por Xcalibur. MS / MS espectros dos quatro mais fortes iões MS acima uma intensidade de 1 × 10 5 foram recolhidos com exclusão dinâmicahabilitado e com a energia de colisão fixada em 35%.
  4. Cada amostra foi executado duas vezes pelo sistema MS-nanoLC LTQ. As amostras de três preparações separadas foram utilizados. Esses péptidos detectáveis ​​em três amostras separadas foram listados nas Tabelas 1 e 2 suplementares. Representativas de espectros de MS nanoLC-LTQ foi ilustrado na Figura 3.

4. Análise de Dados e Banco de Dados Buscando Protein

  1. Cada arquivo RAW foi convertida para um arquivo usando mzXML Readw.exe.
  2. O arquivo foi mzXML entrada em um Sorcerer Sequest 2 sistema e comparados com um banco de dados humana gerada a partir do Centro correspondente Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) banco de dados usando a proteína não-enzimática especificidade. A tolerância de massa do íon precursor foi fixado em 1,5 Da. Uma massa molecular de 16 Da foi adicionado a metionina para pesquisa diferencial para a conta para a oxidação.
  3. Após pesquisar Sequest, os resultados foram filtrados automaticamente, validado umd exibida pelo [Instituto de Biologia de Sistemas (ISB)] PeptideProphet e ProteinProphet. PeptideProphet estima uma probabilidade abrangente pontuação (P) que uma atribuição peptídeo é "correta" versus "incorretas" sobre as bases dos escores de ele Sequest (Xcorr, ΔCn, Sp, RSP) e informações adicionais de cada seqüência do peptídeo identificado. ProteinProphet computado uma pontuação de probabilidade 0-1 para cada proteína com base em peptídeos atribuídos a MS / MS espectros.
  4. Para minimizar falsas identificações positivas foram utilizados rigorosos critérios de filtragem. Primeiro, o corte pontuação mínimo P é fixado em 0,8 por qualquer péptido aceite para assegurar erro muito baixa (muito menos do que 3%) e sensibilidade razoavelmente boa. Em segundo lugar, todos os péptidos com> pontuação P 0,8 deve ter elevados de correlação cruzada (Xcorr) pontuações ao mesmo tempo: 1.9, 2.2, e 3,0 para 1, +2 e 3 de carga.

5. A remoção de bactérias orais com Sondas LLUF

  1. Para determinar a capacidade de sondas para remover o LLUFbactérias orais, saliva antes e após LLUF sonda de recolha (Seção 3) foi espalhada em placas de ágar para detecção bacteriana.
  2. Bactérias foram cultivadas em um antibiótico livre de placa de agar Lauria-Bertani (LB) a 37 ° C durante um dia.
  3. As bactérias anaeróbicas foram cultivadas em um antibiótico livre de placa de agar de caldo de Brucella (BD, Sparks, MD), sob condições anaeróbicas, utilizando Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) a 37 ° C durante um dia.

6. Os resultados representativos

1. Fabricação de sondas LLUF e saliva de amostragem em um ambiente imitado por via oral

Se a saliva de amostragem pode ser realizada como uma sucção pirulito, o procedimento vai evitar a degradação da saliva spitted em dispositivos de recolha de 13-14. É importante ressaltar que ela também se tornará possível monitorar pacientes de forma dinâmica e localmente a partir de cavidade oral. Além disso, se a preparação da amostra usando saliva pode ser simplificada, os clínicos seria facilmente facila facilitar o procedimento para agilizar a sua decisão sobre a próxima operação clínica. A espectrometria de massa é uma das técnicas mais sensíveis para detectar e mesmo as proteínas de sequência em um período muito curto de tempo. No entanto, procedimentos complicados para preparação de amostras têm dificultado o uso desta técnica na clínica. Além disso, sabe-se que maiores proteínas abundância ou proteínas com pesos moleculares elevados em amostras clínicas (por exemplo, amilase na saliva) proteínas de máscara de baixa abundância na análise por espectrometria de massa 15-16. Para ultrapassar as dificuldades acima mencionadas, foi desenvolvido um dispositivo de ultrafiltração lollipop-like chamado sondas LLUF (Figura 1). Uma membrana de polietersulfona carregado negativamente com um PMCO de 30 kDa (Figura 1A, a) foi colada a uma pá de polipropileno (Figura 1A, b). Foi colocado em frente da sonda LLUF com a intenção de filtrar proteínas maiores na saliva. Para simular o ambiente oral humana (Figura 1A, g), Uma esponja (Figura 1A, e) foi embebido em saliva em um prato de cultura (Figura 1A, f). Depois de retirar completamente a seringa (Figura 1A, d), saliva filtrada começou a se mover ao longo de um tubo ligado (Figura 1A, c), e foi recolhido.

2. Identificação de peptidome saliva indígena por nanoLC-LTQ MS

Comparando LC cromatogramas, descobrimos cromatogramas distintos de saliva antes e depois LLUF de amostragem (Figura 2), indicando que existem composições diferentes da proteína na saliva após a amostragem LLUF. Para determinar as composições de proteínas, foram empregados nanoLC-LTQ espectrometria de massa que é conhecido por ser capaz de péptidos de sequências prontamente a partir de uma mistura de proteína múltipla. Mais importante ainda, para simplificar a preparação de amostras para fins clínicos, saliva inteiro sem química ou digestão enzimática foi aplicado para análise LTQ nanoLC-MS. Inesperadamente, 131 péptidos nósre identificado na saliva não digerido (Tabela Suplementar 1). Estes péptidos são fragmentos derivados de várias proteínas ricas prolina, actina, alfa amilase, alfa globina 1, beta-globina, histain 1, queratina 1, mucina 7, receptor de imunoglobulina polimérica, satherin, e S100A9. Vinte e seis péptidos únicos foram identificados na saliva após a filtragem com sondas LLUF (suplementar Tabela 2). Estes péptidos são fragmentos principalmente derivadas de várias prolina proteínas ricas. Os péptidos derivados de proteínas, tais como o receptor de imunoglobulina polimérica (83,24 kDa) e alfa amilase, foram indetectáveis, demonstrando a capacidade das sondas de LLUF na remoção de proteínas maiores e abundante. Um espectro de MS / MS do péptido PFIAIHAEAESKL correspondente a um péptido interno da alfa-amilase é ilustrado na Figura 3A. O mais intrigante, após a remoção de proteínas maiores, 18, ​​de 26 de peptídeos seqüenciados tornou-se detectável na saliva LLUF sonda de amostragem (Tabela1). Estes 18 péptidos foram derivados de prolina proteínas ricas ou proteínas hipotéticas que terminaram com uma prolina (P) -. Glutamina (Q) (-PQ),-SR,-SP-PP ou C-terminal Figura 3B mostram um MS / MS espectro do péptido PQGPPQQGGHPRPP que foi detectado na saliva LLUF sonda-amostrado. O péptido pode ser derivada de prolina-rico subfamília de proteínas HaeIII 1 e 2 (Tabela 1).

figure-protocol-1
Figura 1. As composições de sondas LLUF e amostragem de saliva total a partir de imitar cavidade oral humana Painel A: (a) um polietersulfona semi-permeável com um PMCO de 30 kDa, (b) uma pá de polipropileno, (c) um tubo de teflon propileno fluorado de etileno; (d) uma seringa de 20 ml Painel B:. uma esponja (e) (uma língua simulando) foi embebido em um prato de cultura (f) contendo saliva humana para criaruma cavidade bucal humana artificial (g). A pressão resultante negativa criada pelo totalmente retirada de uma seringa conduz o fluido recolhido para se mover ao longo de um tubo ligado (seta) e na direcção de um espaço criado (ponta de seta) dentro de uma seringa. Bar: 2,0 cm.

figure-protocol-2
Figura 2. Diferencial LC / MS / MS cromatogramas de saliva antes e após a amostragem. LLUF Proteínas (1,0 ug / uL) na saliva humana inteira foi filtrada, sem ou com uma sonda LLUF. Proteínas sem digestão tríptica foram directamente submetido a nanoLC-MS LTQ que foi conjugado com um sistema de Eksigent LC Nano como descrito em Materiais e Métodos. Os cromatogramas de base do pico (com tempos de retenção de 44-MIM) de saliva antes (A) e após (B) de amostragem LLUF foram ilustrados.

figure-protocol-3
Figura 3. Detecção de peptidome saliva pelas proteínas MS nanoLC-LTQ sequenciação. saliva antes (A) e após (B) de amostragem com sondas LLUF foram analisados ​​por nanoLC-LTQ MS tal como descrito em Procedimentos Experimentais. Peptidome saliva derivado de saliva humana natural sem digestão tríptica foram demonstrados nas Tabelas 1 e 2 suplementares. Um péptido (PFIAIHAEAESKL) derivado de alfa-amilase foi exclusivamente detectada em uma amostra de saliva sem recolha com sondas LLUF (A), ilustrando que a capacidade das sondas de LLUF na remoção de proteínas grandes. Muitos peptídeos com-PQ,-SR,-SP ou PP-C-terminais foram apenas em amostras após sondas LLUF ultrafiltração. Um (PQGPPQQGGHPRPP) de péptidos derivados de várias prolina proteínas ricas foram mostrado (B). MS / MS espectros com característica "y" e "b" da série íons confirmou as identidades de ambos os peptídeos.

figure-protocol-4
Figura 4. Remoção de bactérias orais utilizando sondas durante LLUF. Uma sonda de LLUF foi construído como descrito em Materiais e métodos. A sonda foi posicionada no interior da saliva humana dentro de um ambiente imitados por via oral (Figura 1). A seringa no final do LLUF sonda foi retirada para criar uma pressão negativa que levou o processo de ultrafiltração para a amostragem de saliva. Durante a amostragem, saliva total cruzado selectivamente através da membrana de polietersulfona e acumulado no interior de uma seringa. Saliva total antes da amostragem com uma sonda LLUF serviu como um controlo. Saliva (10 uL) antes e após a amostragem LLUF sonda foi espalhada em placas de agar para a detecção bacteriana Painel A:. Saliva com (+ LLUF) e sem (+ LLUF) LLUF amostragem sonda foi espalhada lado-a-lado em um antibiótico livre placa de LB agar a 37 ° C durante um dia B Painel:. Saliva com e sem LLUF amostragem sonda foi espalhada sobre um antibiótico livre de placa de agar de caldo de Brucellasob condições anaeróbicas, usando gás-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) a 37 ° C durante um dia. As bactérias não cresceram em placas de ágar espalhados com LLUF saliva sonda-amostrado, demonstrando a capacidade das sondas de LLCF na eliminação aeróbia, bem como anaeróbios bactérias orais. Bar: 1,0 cm.

Proline-rich proteína subfamília HaeIII 2
Sequência peptídica / massa peptídeo de medição Número de acesso Nome
1 AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ
2485,3 		gi | 41349484 Proline-rich proteína subfamília BstNI uma isoforma 2 precursor
gi | 41349482 Proline-rich proteína subfamília BstNI uma isoforma um precursor
gi | 60301553 Proline-rich proteína subfamília BstNI 2
2 GGHQQGPPPPPPGKPQ
1576,9 		gi | 4826944 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 2
gi | 9945310 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 1
3 GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3126,2 		gi | 37537692 Proline-rich proteína subfamília BstNI 4 precursor
4 GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2028,3 		gi | 113423660 PREVISTA: proteína hipotética
5 GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2077,8 		gi | 113423262 PREVISTA: isoforma proteína hipotética 5
gi | 41349482 Proline-rich proteína BstNI subfamília uma isoforma um precursor
gi | 60301553 Proline-rich proteína subfamília BstNI 2
gi | 113423663 PREVISTA: proteína hipotética
gi | 41349484 Proline-rich proteína subfamília BstNI uma isoforma 2 precursor
gi | 41349486 Proline-rich proteína subfamília BstNI uma isoforma 3 precursor
6 GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2918,5 		gi | 9945310 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 1
7 GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2131,3 		gi | 113423660 PREVISTA: proteína hipotética
8 GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030 		gi | 113423663 PREVISTA: proteína hipotética
gi | 41349482 Proline-rich proteína subfamília BstNI uma isoforma um precursor
gi | 113423262 PREVISTA: isoforma proteína hipotética 5
gi | 60301553 Proline-rich proteína subfamília BstNI 2
9 GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1866,6 		gi | 4826944 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 2
10 GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1713,8 		gi | 9945310 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 1
gi | 4826944
11 GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2083,1 		gi | 9945310 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 1
gi | 4826944 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 2
12 GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2512,6 		gi | 4826944 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 2
gi | 9945310 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 1
13 NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2720,2 		gi | 113423262 PREVISTA: isoforma proteína hipotética 5
gi | 113423663 PREVISTA: hyproteína pothetical
14 PQGPPQQGGHPRPP
1450,1 		gi | 9945310 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 1
gi | 4826944 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 2
15 QGRPQGPPQQGGHPRPP
1791,1 		gi | 4826944 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 2
gi | 9945310 Proline-rich proteína subfamília HaeIII 1
16 SPPGKPQGPPPQ
1186,9 		gi | 113423262 PREVISTA: isoforma proteína hipotética 5
gi | 41349482 Proline-rich proteína subfamília BstNI uma isoforma um precursor
gi | 60301553 Proline-rich proteína subfamília BstNI 2
gi | 113423663 PREVISTA: proteína hipotética
gi | 41349484 Proline-rich proteína subfamília BstNI uma isoforma 2 precursor
gi | 41349486 Proline-rich proteína subfamília BstNI uma isoforma 3 precursor
17 SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2720,3 		gi | 113423663 PREVISTA: proteína hipotética
gi | 41349482 Proline-rich proteína subfamília BstNI uma isoforma um precursor
gi | 113423262 PREVISTA: isoforma proteína hipotética 5
gi | 60301553 Proline-rich proteína subfamília BstNI 2
18 SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1870,9 		gi | 37537692 Proline-rich proteína subfamília BstNI 4 precursor

Peptídeos Tabela 1. Eram exclusivamente detectável no LLUF coleta de amostras.

Tabela Suplementar 1. Clique aqui para ver tabela suplementar 1 .

Tabela Suplementar 2. Clique aqui para ver Tabela 2 suplementar .

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verificou-se que existem muitos fragmentos peptídicos na saliva não digerido humano. Estes fragmentos peptidicos são derivados a partir de várias formas de prolina proteínas ricas, actina, alfa amilase, alfa globina 1, beta-globina, histain 1, queratina 1, mucina 7, receptor de imunoglobulina polimérica, satherin, S100A9. Poderia haver muitos factores que contribuem para a produção de péptidos com sítios de clivagem indeterminadas. Por exemplo, alguns fragmentos peptídicos podem ser naturalmente presente na saliva human...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 e R21-I58002-01). Agradecemos C. Niemeyer para a leitura crítica do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de Catálogo Comentários
Membranas polietersulfona Pall Corporation 30 kDa MWCO
Teflon tubo de propileno fluorado etileno Upchurch Científico
Azul dextrano Sigma
Nano LC sistema Eksigent
Coluna armadilha C18 Agilent 5065-9913
LTQ linear espectrômetro de massa ion trap- Thermo Fisher
Sorcerer 2 Sage-N ReseaRCH
-Acetonitrilo a 0,1% de ácido fórmico JT Baker 9832-03 LC / MS grau
-Água 0,1% de ácido fórmico JT Baker 9834-03 LC / MS grau

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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