Um método de triagem combinatória funcional para obtenção de conhecimentos sobre os impactos da composição molecular de microambientes sobre as funções celulares é descrito. O método tira partido de microarray existentes baseados em tecnologias para gerar matrizes de microambientes definidos combinatórias que suportam a adesão de células e análise funcional.
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Artigo de método
Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays)
Neste artigo
Resumo
Resumo
As interações entre as células e seu microambiente circundante tem consequências funcionais para o comportamento celular. No nível de célula única, microambientes distintos podem impor diferenciação, migração, proliferação e fenótipos, e sobre o nível do tecido processa o microambiente complexo como a morfogénese e tumorigénese 1. Não só o celular e molecular conteúdo de microambientes impacto que as células dentro, mas assim como a elasticidade 2 e 3 geometria do tecido. Definido como a soma total de célula-célula,-ECM, e solúveis em interacções dos factores, para além das características físicas, o microambiente é complexa. Os fenótipos de células dentro de um tecido são parcialmente devido ao seu conteúdo genómico e em parte devido às interacções com o microbiota combinatórias. Um grande desafio é unir combinações específicas de componentes microambientais com comportamentos distintos. ent "> Aqui, nós apresentamos o microambiente microarray plataforma (MEArray) para a célula baseada em triagem funcional de interacções com microambientes combinatórias 4. O método permite um controlo simultâneo da composição molecular e o módulo de elasticidade, e combina a utilização de microarray amplamente disponíveis tecnologias e micropatterning. telas MEArray requerem tão pouco quanto 10.000 células por matriz, o que facilita estudos funcionais de tipos de células raras, tais como as células progenitoras adultas. Uma limitação da tecnologia é que microambientes tecidos inteiros não pode ser completamente recapitulado em MEArrays. No entanto, a comparação das respostas no mesmo tipo de célula a numerosas microambientes relacionados, por exemplo, combinações de pares de proteínas de ECM que caracterizam um dado tecido, irá fornecer informações sobre a forma como os componentes do microambiente eliciar tecido-específicos fenótipos funcionais.
MEArrays podem ser impressos usando uma grande variedade de recombinante grofactores wth, citoquinas, e proteínas purificadas de ECM, e suas combinações. A plataforma é limitado apenas pela disponibilidade de reagentes específicos. MEArrays são passíveis de tempo caduco análise, mas na maioria das vezes são usados para análises de ponto final de funções celulares que são mensuráveis com sondas fluorescentes. Por exemplo, a síntese do DNA, a apoptose, a aquisição de estados diferenciados, ou a produção de produtos de genes específicos são normalmente medidos. Resumidamente, o fluxo de base de um experimento MEArray é preparar as lâminas revestidas com substratos de impressão e para preparar a placa mestre de proteínas que estão a ser impressa. Em seguida, as matrizes são impressas com um robô microarray, as células são deixadas a ligar, crescer em cultura, e, em seguida, são quimicamente fixados ao atingir o ponto de extremidade experimental. Ensaios fluorescentes ou colorimétricas, fotografados com microscópios tradicionais ou scanners microarray, são utilizados para revelar relevantes fenótipos celulares e moleculares (Figura 1).
Protocolo
1. Preparação impressão Substratos
A decisão para usar polidimetilsiloxano (PDMS) com revestimento ou de poliacrilamida (PA)-lâminas revestidas depende dos parâmetros importantes do design experimental. O módulo de elasticidade dos dois polímeros pode ser ajustado para imitar as rigidezes de tecidos diferentes, alterando a relação de base / cura de PDMS, e o rácio de acrilamida / bis-acrilamida de PA. PDMS pode imitar os tecidos mais rígidos na gama de 1-10MPa (por exemplo, cartilagem, a córnea, e as paredes das artérias), e de PA pode imitar os tecidos macios no intervalo entre 100 Pa-100kPa (por exemplo, da mama, do cére....
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Discussão
O método aqui apresentado permite MEArray análises funcionais da célula e interacções microambiente combinatórias 4. Análise MEArray combina o uso de tecnologias micropatterning básicos, biologia celular, e robôs de microarranjos de impressão e dispositivos de análise que estão disponíveis em instalações multiusuários muitos. MEArray telas são compatíveis com tipos de células mais aderentes, embora formulações meios isentos de soro podem necessitar de ser ajustado em alguns casos, de modo a incluir BSA ou <.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
ML é apoiado pela NIA (R00AG033176 e R01AG040081) e pelo Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento Dirigido, EUA Departamento de contrato de Energia # DE-AC02-05CH11231.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Lâminas de vidro 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Lamínulas de vidro (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Prato de coloração (ou frasco Coplan) | VWR | 25461-003 | |
| Placas de petri (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1,0 N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (> 98% de (3-aminopropil) trietoxissilano) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldeído | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% em água |
| APS (> Persulfato de amónio 98%) | Sigma-Aldrich | A3678 | Preparar uma solução de trabalho de 10% com DDQ 2 O |
| TEMED (N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrilamida (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-acrilamida (2% w / v) | Fisher biorreagentes | BP1404-250 | |
| 0,45 um filtro de seringa de nylon de 4 mm | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polidimetilsiloxano) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard kit Elastômero 184 via Adesivos Ellsworth |
| 2-lâminas de câmara | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquselante arium | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Copos plásticos descartáveis | |||
| Abaixadores de língua | |||
| Luvas de borracha nitrílica | |||
| Caixas de plástico de slides de microscópio | |||
| Spin-coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Forno | |||
| Hotplate Digital | |||
| 384 poços | Uma marca adequada para o robô microarray | ||
| Microarray robô impressão | |||
| Fase invertido e microscópio de fluorescência | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Existem várias configurações |
Referências
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage spe....
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Reimpressões e permissões
