Method Article

Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

DOI:

10.3791/4159

July 25th, 2012

In This Article

Summary

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Fluxo de fluido intersticial é elevada em tumores sólidos e pode modular a invasão de células tumorais. Descrevemos aqui uma técnica para aplicar o fluxo de fluido intersticial para as células embebidas numa matriz e, em seguida medir os seus efeitos sobre a invasão celular. Esta técnica pode ser facilmente adaptado para estudar outros sistemas.

Abstract

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O crescimento ea progressão da maioria dos tumores sólidos dependem da transformação inicial das células cancerosas e da sua resposta ao estroma associado à sinalização no microambiente do tumor 1. Anteriormente, a investigação sobre o microambiente do tumor tem se concentrado principalmente em tumores estromais interações 1-2. No entanto, o microambiente do tumor também inclui uma variedade de forças biofísicas, cujos efeitos permanecem pouco compreendidas. Estas forças são conseqüências biomecânicas do crescimento do tumor que levam a mudanças na expressão gênica, a divisão celular, diferenciação e invasão 3. Matriz de densidade 4, rigidez 5-6, 6-7 e estrutura, a pressão do fluido intersticial 8, e fluxo de fluido intersticial 8 são todos alterada durante a progressão do cancro.

Fluxo de fluido intersticial em particular, é maior em tumores em comparação com 8-10 normais tecidos. O fl fluido intersticial estimadoow velocidades foram medidos e verificou-se ser na gama de 0,1-3 uM s -1, dependendo do tamanho do tumor e diferenciação 9, 11. Isto é devido à pressão do fluido intersticial elevada causada por induzida por tumor angiogénese e aumento da permeabilidade vascular 12. Fluxo de fluido intersticial foi mostrado para aumentar a invasão de células de cancro 13-14, fibroblastos vasculares e células de músculo liso 15. Esta invasão pode ser devido aos gradientes de quimiotáticas autólogas criados em torno de células em 3-D 16 ou aumentada metaloproteinase de matriz (MMP) expressão 15, a secreção de quimiocinas e células expressão da molécula de adesão 17. No entanto, o mecanismo pelo qual as células sentir o fluxo de fluido não é bem compreendida. Além de alterar o comportamento das células do tumor, o fluxo de fluido intersticial modula a actividade de outras células no microambiente do tumor. Ele está associado (a) diferenciação de condução de fibroblastos em tumor-promoção myofibroblasts 18, (b) transporte de antigénios e outros factores solúveis para linfonodos 19, e (c) modulando linfático morfogénese de células endoteliais 20.

A técnica aqui apresentada impõe fluxo de fluido intersticial em células in vitro e quantifica os seus efeitos sobre invasão (Figura 1). Este método tem sido publicado em vários estudos para medir os efeitos de fluxo de fluido sobre estroma e invasão de células do cancro 13-15, 17. Ao alterar a composição da matriz, tipo de célula, e concentração de células, este método pode ser aplicado a outras doenças e sistemas fisiológicos para estudar os efeitos de fluxo intersticial em processos celulares, tais como invasão, diferenciação, proliferação e expressão de genes.

Protocol

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1. Ensaio Set-up

  1. Descongelar uma pequena alíquota (
    • Preparar receita gel (ver volumes exemplo na Tabela em baixo): PBS 10x (1x em volume total), hidróxido de sódio 1N (equivalente a 0,023 volumes de colagénio adicionado, ou segundo as recomendações do fabricante de colagénio, como apropriado), Matrigel e colagénio do tipo I para concentrações finais de 1 mg / ml e 1,3 mg / ml, respectivamente (formulações de matriz podem ser utilizados outros dependendo do tipo de célula e da experiência).

Receita gel exemplo

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Discussion

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Aqui temos descrito um método para quantificar o efeito do fluxo intersticial na invasão de células de tumor, utilizando células embebidas numa matriz de 3-D dentro de uma inserção de cultura de célula. Isto e métodos semelhantes têm sido utilizados para estudar o efeito de fluxo intersticial em uma variedade de tipos de células 13-15, 17. A nossa abordagem parcialmente imita o microambiente matriz do tumor usando colagénio tipo I e Matrigel que contêm proteínas encontradas na membrana basal de tecido epiteli.......

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Disclosures

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Não há conflitos de interesse declarados.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
Colágeno (cauda de rato) BD 354236 Mantenha estéril
Millicell inserção de cultura de célula Millipore PI8P01250 8 diâmetro de poro iM, policarbonato membrana
Matrigel BD 354234 Mantenha estéril
PBS Sigma Aldrich 100M-8202 10x para a preparação de solução de gel, 1x para a lavagem passos
Hidróxido de sódio em solução 1,0 N Sigma Aldrich S2770 Mantenha estéril
DMEM 1X CellGro 10-013-CV Mantenha estéril
Soro Fetal Bovino Atlanta Biologicals 511150 Mantenha estéril
Estreptomicina penicilina CellGro 30002CI Mantenha estéril
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-500 ml 0,5% em PBS
Paraformaldeído Fisher Scientific 04042-500 4% em PBS
Água deionizada Mantenha estéril
4 ',6-diaminido-2-fenilindol (DAPI) Biomedicals MP 0215757401 1 mg / ml de solução stock
Solução de montagem Thermo Scientific TA-030-FM
Tripsina-EDTA CellGro 25-052-CI Mantenha estéril

References

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  1. Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
  2. Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell....

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Interstitial Fluid FlowTumor Cell Invasion3D Cell CultureCollagen Matrigel GelTranswell AssayStatic Flow ConditionsCell Migration AnalysisMDA MB 435 CellsFluorescent StainingInvasion Quantification

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