Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

Resumo

Fluxo de fluido intersticial é elevada em tumores sólidos e pode modular a invasão de células tumorais. Descrevemos aqui uma técnica para aplicar o fluxo de fluido intersticial para as células embebidas numa matriz e, em seguida medir os seus efeitos sobre a invasão celular. Esta técnica pode ser facilmente adaptado para estudar outros sistemas.

Resumo

O crescimento ea progressão da maioria dos tumores sólidos dependem da transformação inicial das células cancerosas e da sua resposta ao estroma associado à sinalização no microambiente do tumor ^1. Anteriormente, a investigação sobre o microambiente do tumor tem se concentrado principalmente em tumores estromais interações ^1-2. No entanto, o microambiente do tumor também inclui uma variedade de forças biofísicas, cujos efeitos permanecem pouco compreendidas. Estas forças são conseqüências biomecânicas do crescimento do tumor que levam a mudanças na expressão gênica, a divisão celular, diferenciação e invasão ^3. Matriz de densidade ^4, rigidez ^{5-6, 6-7} e estrutura, a pressão do fluido intersticial ^8, e fluxo de fluido intersticial ⁸ são todos alterada durante a progressão do cancro.

Fluxo de fluido intersticial em particular, é maior em tumores em comparação com ^8-10 normais tecidos. O fl fluido intersticial estimadoow velocidades foram medidos e verificou-se ser na gama de 0,1-3 uM s ^-1, dependendo do tamanho do tumor e diferenciação ^{9, 11.} Isto é devido à pressão do fluido intersticial elevada causada por induzida por tumor angiogénese e aumento da permeabilidade vascular ^12. Fluxo de fluido intersticial foi mostrado para aumentar a invasão de células de cancro ^13-14, fibroblastos vasculares e células de músculo liso ^15. Esta invasão pode ser devido aos gradientes de quimiotáticas autólogas criados em torno de células em 3-D ¹⁶ ou aumentada metaloproteinase de matriz (MMP) expressão ^15, a secreção de quimiocinas e células expressão da molécula de adesão ^17. No entanto, o mecanismo pelo qual as células sentir o fluxo de fluido não é bem compreendida. Além de alterar o comportamento das células do tumor, o fluxo de fluido intersticial modula a actividade de outras células no microambiente do tumor. Ele está associado (a) diferenciação de condução de fibroblastos em tumor-promoção myofibroblasts ^18, (b) transporte de antigénios e outros factores solúveis para linfonodos ^19, e (c) modulando linfático morfogénese de células endoteliais ^20.

A técnica aqui apresentada impõe fluxo de fluido intersticial em células in vitro e quantifica os seus efeitos sobre invasão (Figura 1). Este método tem sido publicado em vários estudos para medir os efeitos de fluxo de fluido sobre estroma e invasão de células do cancro ^{13-15, 17.} Ao alterar a composição da matriz, tipo de célula, e concentração de células, este método pode ser aplicado a outras doenças e sistemas fisiológicos para estudar os efeitos de fluxo intersticial em processos celulares, tais como invasão, diferenciação, proliferação e expressão de genes.

Protocolo

1. Ensaio Set-up

1. Descongelar uma pequena alíquota (
   • Preparar receita gel (ver volumes exemplo na Tabela em baixo): PBS 10x (1x em volume total), hidróxido de sódio 1N (equivalente a 0,023 volumes de colagénio adicionado, ou segundo as recomendações do fabricante de colagénio, como apropriado), Matrigel e colagénio do tipo I para concentrações finais de 1 mg / ml e 1,3 mg / ml, respectivamente (formulações de matriz podem ser utilizados outros dependendo do tipo de célula e da experiência).

Receita gel exemplo

Componentes	Concentração estoque	Concentração Final	Adicionar o volume
PBS 10X	10X	1X	0,090 ml
Água estéril			0,346 ml
NaOH 1N			0,008 ml
Matrigel	9,90 mg / ml	1 mg / ml	0,101 ml
Rat cauda colágeno tipo I	3,66 mg / ml	1,3 mg / ml	0,355 ml

3. Misturar os componentes do gel em gelo na mesma sequência como acima e solução final incubar durante 1 hr a 4 ° C. Na nossa experiência, uma incubação de 1 hora antes da semeadura das células resultados em uma gelificação mais uniforme do colagénio. Certifique-se manter Matrigel e colágeno no gelo em todos os momentos e trabalhar o mais rápido possível para evitar gelificação.
4. Coloque 12 mm de diâmetro 8 mM insere celulares poros cultura em uma placa de 12 poços usando uma pinça esterilizada.
5. Contar as células e ressuspender em meio isento de soro a 5 x 10 ⁶ células / ml (volume total deve ser de 10% da solução de gel).
6. Adicionar 100 ul de su célulaspension a 900 ml de solução-gel (concentração celular final de 5 x 10 ⁵ células / ml) e misture bem por pipetagem suavemente para cima e para baixo.
7. Adicionar 150 ul da mistura final para cada inserção e transferência para uma 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante 30 minutos até gel polimeriza.
8. Usando meios isentos de soro,

• Adicionar 100 uL no topo do gel e 1200 uL sob o inserto para a condição estática. Os níveis de fluido no interior do inserto e fora do poço deve ser aproximadamente igual, resultando em diferença de pressão mínima através do gel e sem fluxo intersticial.
• Adicionar 100 ul sob a inserção e 650 uL acima gel para a condição de fluxo. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar abaixo da inserção, como eles vão evitar que as células migrem através da membrana a esses locais. A diferença de pressão gerado por estes volumes é de aproximadamente 1,3 centímetros _de H2O (ou 1 mm Hg).

9. Coloque em uma placa de 37° C, 5% de CO ₂ incubadora durante 24 horas.

2. Células coradas e Contagem

1. Adicionar 500 ul de PBS 1X por poço em placas de 24 poços novo, o que irá ser usada para lavar as inserções.
2. Remover o meio restante na porção superior dos transwells de fluxo e determinar o volume. Calcular o volume total de fluido, subtraindo o volume remanescente a partir do volume total originalmente adicionado, 650 uL (isto será usado para os cálculos de taxa de fluxo, ver abaixo). Use cotonetes para remover o gel a partir dos insertos e para limpar a superfície superior da membrana para remover as células não-invadidas. Colocar as inserções na placa de 24 poços contendo 1X PBS durante 15 s para lavar inserções.
3. Remover PBS e adicionar 500 uL de paraformaldeído a 4% (PFA) por baixo de cada inserto e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente, para fixar as células transmigradas.
4. Remover o PFA e enxaguar uma vez com 500 ul 1X PBS para remover fixador residual.
5. Adicionar 500 o ulf 0,5% de Triton X-100 solução sob as inserções e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente para permeabilizar as células.
6. Cortar as membranas para fora da inserção usando uma lâmina de barbear e coloque em 100 uL de 2 ug / ml em 1X DAPI solução de PBS, tendo o cuidado de a colocar o lado de baixo da face da membrana para baixo (células transmigradas viradas para baixo).
7. Placa de envoltório em folha de alumínio e local num agitador a 150 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente.
8. Lave as membranas em 500 uL de PBS 1X em agitador (repetição 3 vezes durante 10 minutos cada) para remover DAPI livre.
9. Membranas Coloque as lâminas de vidro com células transmigradas voltadas para cima, adicione solução de montagem e lamínula.

3. Análise de Dados

1. Conte DAPI manchado de núcleos em 5 locais selecionados aleatoriamente de cada membrana (ficar longe das bordas e use um 10x ou 20x lente objetiva).
2. Calcula-se a contagem média de células e obter a invasão por cento usando a seguinte fórmula:
   Invasão por cento x = 100% (média contagem de células x área de superfície de membrana) / (área de superfície do número x microscópio imagem de células semeadas)
   A invasão por cento pode ser normalizado a uma condição de controlo (geralmente a condição estática) para permitir a comparação entre experiências independentes.
3. Calcular a taxa de fluxo médio: dividir o volume total eluído na condição de fluxo pelo tempo de incubação (por exemplo, 24 hr).
4. Calcula-se a velocidade de fluxo médio: dividir a taxa de fluxo médio pela área da secção transversal do gel / membrana (neste caso 60 milímetros ^2).

4. Os resultados representativos

Para medir a invasão de células tumorais sob fluxo intersticial, foi realizada a nossa 3-D ensaio de invasão de fluxo, utilizando MDA-MB-435S células de melanoma metastático. Estas células têm sido anteriormente demonstrado que invadem em resposta ao fluxo de fluido intersticial ^13-14. As células foram incorporados em uma matriz composta de 1,3 mg / rato ml tail colagénio do tipo I e do tendão de 1 mg / ml Matrigel matriz da membrana basal, a uma concentração celular final de 5 x 10 ⁵ células / ml. Duas condições diferentes foram comparados: (1) o fluxo intersticial média = 0,1 uM s ^-1 e (2) condição estática = não caudal mensurável (Figura 1).

Após 24 horas, as células que invadiram através dos poros da membrana foram coradas com DAPI para facilitar a contagem das células. A Figura 2 mostra uma imagem representativa das células invadidas. Sob brightfield, apenas os poros da membrana são visíveis. Usando de fluorescência, os núcleos DAPI manchado foram utilizados para a contagem de célula e os faloidina coradas F-actina estruturas foram utilizados para visualizar o corpo da célula (opcional). Usando um teste t de Student-assumindo variâncias iguais, mostrámos que o fluxo intersticial aumenta significativamente MDA-MB-435S invasão de células de 2,3 vezes em relação a condições estáticas (p = 0,003) (Figura 3). Esta corroboraçãotes resultados semelhantes (mas com as condições da matriz diferentes e, portanto, velocidades de fluxo), utilizando esta linha de células de ^13-14.

Figura 1. Esquemático do intersticial ensaio de fluido 3-D invasão de fluxo. Primeiro preparar solução de gel utilizando concentrações apropriadas e volumes. Em seguida, adicionar as células a solução de gel e transferir para inserções de cultura de células. Finalmente adicionar volume adequado de meios de comunicação para cada condição e incubar. Fluxo de fluido intersticial é accionado por uma cabeça de pressão de fluido.

Figura 2. Transmigradas MDA-MB-435S células em membrana. Células invadidas foram fixados após a nossa intersticial ensaio de invasão do fluxo do fluido e corados com DAPI e Alexa Fluor 488-conjugados faloidina para facilitar a contagem de células invadidas; A Picture) da membrana em campo claro; B) DAPI stanúcleos INED (em azul); C) Alexa Fluor 488-faloidina manchado F-actina (em verde). Barra de escala representa 50 um.

Figura 3. Da invasão de MDA-MB-435S células sob fluxo. Invasão celular após 24 hr significativamente melhorada pelo fluxo intersticial (p = 0,003). Os resultados são normalizados para a condição média estático e os valores representam a média ± SEM de 6 inserções de cultura de células.

Discussão

Aqui temos descrito um método para quantificar o efeito do fluxo intersticial na invasão de células de tumor, utilizando células embebidas numa matriz de 3-D dentro de uma inserção de cultura de célula. Isto e métodos semelhantes têm sido utilizados para estudar o efeito de fluxo intersticial em uma variedade de tipos de células ^{13-15, 17.} A nossa abordagem parcialmente imita o microambiente matriz do tumor usando colagénio tipo I e Matrigel que contêm proteínas encontradas na membrana basal de tecido epiteli...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Colágeno (cauda de rato)	BD	354236	Mantenha estéril
Millicell inserção de cultura de célula	Millipore	PI8P01250	8 diâmetro de poro iM, policarbonato membrana
Matrigel	BD	354234	Mantenha estéril
PBS	Sigma Aldrich	100M-8202	10x para a preparação de solução de gel, 1x para a lavagem passos
Hidróxido de sódio em solução 1,0 N	Sigma Aldrich	S2770	Mantenha estéril
DMEM 1X	CellGro	10-013-CV	Mantenha estéril
Soro Fetal Bovino	Atlanta Biologicals	511150	Mantenha estéril
Estreptomicina penicilina	CellGro	30002CI	Mantenha estéril
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500 ml	0,5% em PBS
Paraformaldeído	Fisher Scientific	04042-500	4% em PBS
Água deionizada			Mantenha estéril
4 ',6-diaminido-2-fenilindol (DAPI)	Biomedicals MP	0215757401	1 mg / ml de solução stock
Solução de montagem	Thermo Scientific	TA-030-FM
Tripsina-EDTA	CellGro	25-052-CI	Mantenha estéril