Um procedimento otimizado para fluorescência-ativado Isolamento classificação celular (FACS) da Autônomo progenitores neurais a partir de vísceras de ratos fetais

Resumo

Um procedimento otimizado para purificar crista neural derivados progenitores neuronais a partir de tecidos fetais de camundongos é descrito. Este método tira partido da expressão a partir de alelos repórter fluorescente para isolar populações discretas por fluorescência-activated separação de células (FACS). A técnica pode ser aplicada para isolar subpopulações neuronais ao longo do desenvolvimento ou a partir de tecidos adultos.

Resumo

Durante o desenvolvimento da crista neural (CN) derivados progenitores neuronais migrar do tubo neural para formar gânglios autonômicos em órgãos viscerais, como o intestino e do trato urinário inferior. Tanto durante o desenvolvimento e em tecidos maduros estas células são muitas vezes muito dispersos ao longo tecidos de modo a que o isolamento de populações discretas usando métodos como a laser de captura de micro-dissecção é difícil. Podem, contudo, ser directamente visualizadas por expressão de repórteres fluorescentes conduzidos a partir de regiões reguladoras de genes específicos de neurónios como tirosina hidroxilase (TH). Nós descrevemos um método optimizado para altos rendimentos de TH + de viável progenitoras neuronais a partir de tecidos de rato fetal viscerais, incluindo intestino e inferior do tracto urogenital (LUT), com base na dissociação e de fluorescência-activated separação de células (FACS).

O gene codifica Th a enzima limitante para a produção de catecolaminas. Entéricas progenitores neuronais começam a expressar TH durção a sua migração no intestino fetal ¹ e TH também está presente em um subconjunto de adultos neurónios dos gânglios pélvicos ^2-4. O primeiro aparecimento dessa linhagem ea distribuição destes neurónios em outros aspectos da LUT, e seu isolamento não foi descrita. Progenitores neuronais que expressam TH pode ser prontamente visualizadas por expressão de GFP em ratinhos que transportam o transgene construto Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc ^1. Nós imaged expressão deste transgene em ratinhos fetais para documentar a distribuição de TH + células na LUT desenvolver-se a 15,5 dias pós coito (DPC), designando a manhã de detecção do conector como 0,5 DPC, e observou-se que um subconjunto de células progenitoras neuronais no coalescência pélvica gânglios expressa EGFP.

Para isolar TH LUT + progenitores neuronais, otimizamos métodos que foram inicialmente utilizados para purificar células da crista neural estaminais do intestino do rato fetal ^2-6. Esforços anteriores para isolar NC derivados populações invocadosdigestão com um cocktail de colagenase e tripsina para se obter suspensões de células por citometria de fluxo. Nas nossas mãos estes métodos produzido suspensões de células a partir da LUT com viabilidade relativamente baixo. Dada a incidência já baixo de progenitores neuronais nos tecidos fetais LUT, partimos para otimizar métodos de dissociação de tal forma que a sobrevivência da célula nos dissocia finais seriam aumentados. Nós determinamos que a dissociação suave em Accumax (Cell Technologies, Inc Inovadoras), manual de filtragem, classificação e fluxo a baixas pressões nos permitiram alcançar consistentemente maior sobrevivência (> 70% do total de células) com rendimentos posteriores de progenitores neurais suficientes para a análise a jusante. O método descrevemos podem ser amplamente aplicado para isolar uma variedade de populações neuronais a partir de qualquer fetais ou adultos tecidos de murino.

Protocolo

1. Preparação de meios de (Todos os passos feito em capuz cultura de tecidos)

1. Combinar o seguinte: 44 L-15 ml de Meio, 0,5 ml 100X penicilina / estreptomicina (P / S), 0,5 ml de 100 mg / ml de Albumina de Soro Bovino (BSA), 0,5 ml de HEPES 1M, 5 ml de água de grau Tissue Culture. Certifique-se de misturar BSA e P / S bem antes de adicionar. Este volume deve ser adequada para a dissociação de até cinco tipos diferentes tecidos. Esse tipo de material será usado no Passo 3,4 para preparar soluções Quenching para uso após dissociação enzimática de tecido.
2. Meio Filtrante embora de 0,22 Polietersulfona filtro (PES).
3. Prepare a solução de 1X de....

Discussão

Linhas de rato que expressam repórter repórteres fluorescentes estão se tornando amplamente disponível através de múltiplos esforços no murino genética comunidade ^1,8,9. Como resultado do método de dissociação ilustrado aqui pode ser amplamente aplicado para o isolamento de discretas subtipos neuronais com base em neurotransmissor ou padrões de expressão de receptor a partir de ambos os tecidos fetais ou adulto. Embora tenhamos optimizado este método baseado na expressão de um transgene repórter fluorescente,.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Vendedor	Número de Catálogo	Comentários
Accumax	Sigma (MFR: Cell Technologies Inovadoras)	A7089-100ML	Armazenar congelados em alíquotas de 1 ml
DNase I	Sigma	D-4527	Armazenadas congeladas a -20 ° C 5 mg / ml em 1xHBSS, (Usado em Têmpera, Têmpera 1:5)
PH 7,4 PBS 10X	Gibco	70011-044	Faça até 1x com água grau cultura de tecido, em seguida, filtro estéril
10X HBSS w / o Ca ou Mg	Gibco	14185-052	Faça até 1x com água grau cultura de tecido, em seguida, filtro estéril
L-15 de Leibovitz médio	Gibco	21083027
Penicilina / estreptomicina 100X	Gibco	15140-133	Loja aliquotadas a -20 ° C
BSA	Sigma	A3912-100G	Armazenar aliquotadas a -20 ° C, 100 mg / ml em água
BioWhittaker 1M HEPES em NaCl 0,85%	Lonza	17-737E
38 mM Nitex membrana de náilon	Sefar América	3-38/22	Corte em quadrados ~ 3 cm. UV tratar durante a noite para esterilizar no capuz de cultura de tecidos.
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg / ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 tubos de poliestireno ml	Falcão	352058
15 ml tubos cónicos	Corning	430790
Belas Pinças de dissecação	Belas instrumentos científicos	11251-30	Dumont # 5 forcep, Dumoxel, padrão ponta 0.1x0.06mm
Dissecando Colher	Belas instrumentos científicos	10370-18