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Todos os procedimentos que envolvem manipulação de animais foram aprovados pela Universidade de Toronto Comitê Animal Care, de acordo com as diretrizes institucionais (protocolo no. 20009387). Os métodos que se seguem devem ser realizados utilizando ferramentas e técnicas estéreis, numa câmara de fluxo laminar, onde aplicável.
No texto do protocolo a seguir, a frase "EFH-SFM" refere-se a meio isento de soro suplementado com factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento de fibroblastos básico e heparina. EFH-SFM é usado quando a investigar o galvanotaxis de NPCs indiferenciadas, porque esses mitógenos manter NPCs em sua 4 estado indiferenciado. Ao investigar a galvanotaxis de NPCs induzidas a diferenciar-se em tipos de células maduras, "FBS-SFM" refere-se a meio isento de soro suplementado com 1% de soro fetal bovino. FBS promove a diferenciação de maduras NPCs em fenótipos neurais 5.
1. Isolamento e Cultura de precursores neurais (Nãomostrado em video)
- Anestesiar um rato CD1 (6-8 semanas de idade) com isofluorano e sacrifício através de deslocamento cervical.
- Extinguir a cabeça em etanol a 70% e decapitar o animal com tesouras de dissecação afiadas.
- Enquanto mantém a cabeça com pinça cirúrgica, remover a pele na superfície dorsal para expor o crânio.
- Usando um bisturi e não. Lâmina 11, marcar o crânio no seio frontal ao longo do eixo mediolateral, e também ao longo da sutura sagital na direcção rostrocaudal.
- Descasque os ossos parietais de distância da cabeça com nenhum. 7 pinças curvas, tendo cuidado para não furar o tecido cerebral.
- Insira uma espátula fina embaixo do cérebro a partir de debaixo do cerebelo e avançando para os bulbos olfatórios. Enquanto segurando o crânio no lugar com uma pinça, puxe o cérebro do crânio e imediatamente colocá-lo na gelada líquido cefalorraquidiano artificial (veja receitas abaixo).
- Sob um microscópio de dissecação, utilizando estériltesouras e pinças de dissecção cortar o cérebro de meia ao longo da linha média. Rodar cada hemisfério, de modo que a superfície (cut) medial virado para cima.
- Selecione um hemisfério, e com a superfície medial voltada para cima, localize o esplênio do corpo caloso (região posterior do corpo caloso).
- Fazer uma incisão da superfície do córtex do esplênio do corpo caloso ao longo do eixo dorsoventral.
- Descasque o córtex incisão em direção ao bulbo olfativo para expor as paredes medial e lateral do ventrículo lateral.
- Girar o hemisfério, de modo que a superfície dorsal virada para cima, e usar microtesoura curvadas para cortar e recolher as paredes expostas medial e lateral, que contêm a região periventricular onde residem NPCs 6.
- Repita os passos 1,8-1,11 para o outro hemisfério.
- Pipetar a tecido isolado em 7 ml de solução de tripsina (ver receita abaixo) num tubo de 15 cc, e colocar o tubo sobre um balancim de 37 ° Cincubadora durante 25 min.
- Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 5 min, o sobrenadante aspirado, e ressuspender o tecido em 2 ml de solução de inibidor de tripsina (ver receita abaixo).
- Tritura-se o tecido suavemente com um pequeno furo de pipetas de Pasteur 30-50 vezes com cuidado para evitar bolhas de ar.
- Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 5 min, o sobrenadante aspirado, e ressuspender em 1-2 ml de SFM (ver receita abaixo) por trituração do pellet 3-5 vezes.
- Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 3 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de SFM + EFH.
- Conte viver a densidade celular com um hemocitómetro e as células da placa num frasco de cultura T25, a uma densidade de 10 células por uL de SFM + EFH.
- Permitir que a cultura a crescer durante 7 dias não perturbadas para render flutuantes neuroesferas primárias compostas por NPCs.
2. Galvanotaxis Preparação Câmara
- Coloque 3 de vidro quadrado não. 1 lamelas (22 x 22 x 0,17) ind garrafa de 6N de ácido clorídrico durante a noite.
- No dia seguinte, utilizar uma ponta de diamante, cortador de vidro para cortar seis tiras rectangulares (22 x 5 x 0,17 mm) de vidro a partir de qualquer quadrado. 1 lamínulas.
- Transfira os deslizamentos lavado com ácido quadrados e retangulares deslizamentos em uma capela de fluxo laminar. Lave as tiras rectangulares e quadradas, primeiro com etanol 70%, em seguida com água de cultura de tecidos de grau autoclavado, e deixa-se secar numa Kim Wipe (para esterilidade adicionado, o vidro pode ser permitido para o ar seco).
- Aplique graxa de vácuo para o perímetro de uma superfície das lâminas de vidro quadrados, e vedá-las à base de 60 mm pratos de Petri de plástico.
- Aplique graxa de vácuo ao longo do eixo longo de uma superfície das tiras de vidro rectangulares e selá-los às arestas opostas das lâminas de vidro quadrados (de tal forma que elas fiquem paralelas umas às outras), a fim de criar uma calha central.
- UV-esterilizar as câmaras durante pelo menos 15 min no fluxo laminar.
- Pipetar 250-300 ul de poli-L-Lysine para a calha central das câmaras e incubar à temperatura ambiente durante 2 horas.
- Aproximadamente 15 minutos antes do final do período de incubação, a preparação da solução de Matrigel (ver receita abaixo).
- Aspirar o poli-L-lisina, lave as calhas centrais com 1 ml de água esterilizada, e uL de solução da pipeta 250-300 Matrigel para as calhas centrais.
- Incubar as câmaras, a 37 ° C durante 1 h.
- Aspirar a solução Matrigel e lavar cuidadosamente as calhas centrais com 1-2 ml de SFM.
- Pipetar 100 mL de EFH-SFM ou FBS-SFM para as calhas centrais e transferir as câmaras galvanotaxis para o palco de um microscópio de contagem.
- Pipetar 3-4 ml da cultura neuroesfera contendo em uma placa de Petri de 60 mm e transferir a placa de Petri, para o estágio de microscópio de contagem.
- Se a um objectivo de visualização de 5x, utilizar uma pipeta para transferir P10 5-8 neuroesferas inteiras (até quatro de cada vez) na calha central de cada galvanotaxiscâmara sem dissociar-los, e cuidadosamente espalhado as neuroesferas redor da calha central, sem perturbar o substrato Matrigel.
- Adicionar um adicional de 150-200 ul EFH-SFM ou FBS-SFM para as calhas centrais.
- Transferir as câmaras galvanotaxis em um de 37 ° C, 5% CO 2, 100% incubadora humidificada durante 17-20 h (se analisar NPCs indiferenciadas) para permitir que as neuroesferas a aderir ao substrato de Matrigel e dissociam-se em células individuais, como mostrado na Figura 1 . Se a análise de NPCs diferenciados, o período de incubação deve ser alargado para 69-72 horas para permitir a diferenciação das células.
3. Viver imagens de células Time-Lapse
- Permitir que o sistema de imagens ao vivo de células para equilibrar a 37 ° C, 5% CO 2 durante um período mínimo de 30 min antes do início da gravação de lapso de tempo.
- Corte dois pedaços de 12 cm de 1 mm de diâmetro prata fio da bobina, eles de um lado, e colocá-los em Clorox blixiviação durante 20 minutos de modo a formar de Ag / AgCl.
- Transferir as câmaras galvanotaxis para a plataforma de um microscópio de contagem e seleccionar que câmara irá ser utilizada para a análise de células live-migração de imagem com base nos seguintes critérios: i) as neuroesferas deve ser quase completamente dissociado em células individuais e, ii) as células devem possuir morfologias redondas com pouco ou nenhum processo que se estende dos corpos celulares.
- Transferir a câmara galvanotaxis seleccionado numa câmara de fluxo laminar, em conjunto com um qualquer quadrado separado. Uma lamínula de vidro e graxa de vácuo.
- Lava-se a tampa desliza em primeiro lugar com 70% de etanol, em seguida, em água esterilizada, e aplicar uma tira de massa lubrificante de vácuo sobre dois bordos paralelos da lâmina de cobertura.
- Aspirar o meio de cultura a partir da calha central da câmara, em seguida, rapidamente colocar a lâmina de cobertura (graxa lado voltado para baixo) para a câmara de tal modo que a gordura restante nas duas tiras paralelas tiras de vidro rectangulares, criando efectivamente um telhadopara a câmara.
- Pipetar 100 mL de fresco EFH-SFM ou FBS-SFM na calha central através de ação capilar.
- Use graxa de vácuo para criar bordas de piscinas de meios de cultura em cada extremidade da calha central, como mostrado na Figura 2.
- Cortar duas peças 15 cm de tubo de PVC, e com uma seringa de 10 cc com uma agulha de calibre 18 para injectar a solução de agarose cuidadosamente no tubo, garantindo não formar bolhas no interior dos tubos, e permitir que o gel solidificar durante 5 min.
- Transferir a câmara galvanotaxis ao sistema vivo de células de imagem, juntamente com o gel de agarose a tubos, Ag / AgCl, e um par de vazios 60 pratos de Petri milímetros que serão utilizados como meios de cultura reservatórios e irá conter o Ag / AgCl. Permitir que a câmara galvanotaxis para descansar dentro do 37 ° C, 5% CO 2 ambiente durante 20-30 min.
- Durante este tempo, preparar as tampas dos dois pratos de Petri vazias e da tampa da caixa de Petri a câmara de galvanotaxis por furos de perfuraçãoneles com uma ferramenta Dremel ou semelhante, como mostrado na Figura 3.
- Pipetar 1-1,5 ml de EFH-SFM ou FBS-SFM para um ou outro lado da calha central, e 7-8 ml de SFM em cada placa de Petri vazia. Coloque uma placa de Petri em cada lado da calha central da câmara e galvanotaxis lugar um eléctrodo de Ag / AgCl em cada prato. Ponte o espaço entre a câmara de galvanotaxis e as placas de Petri para estabelecer a continuidade eléctrica com as pontes de gel de agarose, como se mostra na Figura 4.
- Conectar os eletrodos de Ag / AgCl a uma fonte de alimentação externa, com um amperímetro em série para medir a corrente elétrica e ligue a fonte de alimentação. Use um voltímetro para medir a força do campo eléctrico em frente da calha central, e ajustar a saída da fonte de alimentação até que a intensidade do campo eléctrico desejado é alcançado (os ensaios realizados neste laboratório utilizam uma força dcEF de 250 mV / mm com corrente eléctrica entre 1 e 1,5 mA).
- Iniciativate módulo do lapso de tempo no sistema de célula de imagem ao vivo, e permitir que o experimento de correr para a quantidade de tempo desejada. Após a conclusão do ensaio, as células de fixação em paraformaldeído a 4%, para análise de imunomarcação padrão.