Application Notes

항체 배열을 사용하여 수용체 티로신 키나제 인산화의 프로파일 변경 - 광고

Released: September 27, 2012 doi: 10.3791/4199

Greta J. Wegner¹, David J. Finkel¹, Amy E. James¹, Richard A. Krzyzek¹

¹Array Group, Assay Department, R&D Systems, Inc.

Summary

프로테옴 프로파일 항체 어레이는 수많은 immunoprecipitation (IP) 서부을 수행하지 않고 수용체 티로신 키나제의 (RTK) 인산화의 변화에 대한 화면으로 편리하고 비용 효율적인 방법입니다. ARY001 인간 RTK 배열은 chemiluminescence 감지를 사용하여 하나의 샘플에서 여러 RTKs의 질적 측정 할 수 있습니다.

Abstract

수용체 티로신의 키나제 (RTK) 표현과 인산화의 dysregulation이 자주 암 세포의 개발 및 전이성 확산과 연결되어 있습니다. ^1-3 상당한 노력은 특정 RTKs을 타겟팅과 질병 상태와 관련된 비정상 신호 경로를 방해 개발 억제제에 집중되었습니다 . 본 연구의 ^4-7 목적은 RTK의 인산화에 대한 억제제의 선택 수의 효과를 측정하는 것이 었습니다. 이 연구는 단일 샘플로 동시에 다수의 RTKs에 대한 인산화의 증가 또는 감소를 모니터링 할 수있는 멤브레인 기반의 샌드위치 면역 분석법 인 인간 Phospho-RTK 배열을 사용 하였다. 이 분석에서 모두 phosphorylated과 unphosphorylated RTKs는 lysate 샘플에 존재는 니트로 셀룰로스 막 현미경 슬라이드의 크기에 걸쳐 복제에 인쇄 이산 항체에 의해 캡처됩니다. 세척 후, 배열, 안티 phospho-티로신 - 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP)와 incubated 아르배열에 캡처 한 phosphorylated RTKs로하는 샌드위치. 두 번째 세척 단계 후, 배열 chemiluminescent 시약과 incubated 수 있습니다. 각 배열 지점에서 생성 신호는 각 캡처 항체에 의해 구속 phospho-단백질의 양에 비례합니다. 이 실험에서, 배열은 MDA-MB-453의 유방암 또는 가토 III 위 암 세포뿐만 아니라, ErbB에 대한 선택적 억제제로 세포의 치료와 관련된 인산화의 감소를 특징하는 하나의 리간드 자극에 따라 인산화의 증가를 측정하는 데 사용 된 또는 FGF R의 가족.

Protocol

1. 샘플 준비

인간 Phospho-RTK 어레이 데이터 시트에있는 지침에 따라 치료, 리간드는 치료, 또는 방지제와 리간드 치료 세포 lysates를 수집합니다. 용해 버퍼는이 키트에 최적화되었습니다. 다른 용해 버퍼의 대체는 배열의 마지막 성능에 영향을 미칠 수 있습니다. proteolytic 샘플 저하를 방지하기 위해, 10 μg / ML Aprotinin, 10 μg / ML 류 펩틴, 10 μg / ML Pepstatin 각 사용에 대한 신선한 각각의 세포 lysate 준비에 필요한 용해 버퍼의 양을 추가합니다.
Lysate 농도는 bicinchoninic 산 (BCA) 분석을 사용하여 측정해야합니다. 샘플 농도는 경험적으로 최적의 감도 및 낮은 배경에 맞게 변경 될 수 있습니다. lysate의 100-300 μg의 범위는 초기 시작 지점으로하는 것이 좋습니다.
샘플의 동결 / 해동 사이클은 피해야합니다 그리고 lysates의 적절한 저장 용량은 최적의 성능을 위해 필요합니다. 얼음에 냉동 lysate 샘플을 해동.

사용하기 전에 실온에 모든 키트 구성 요소를 가져와. 절차를 수행하는 동안 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용하십시오.
사용되는 4 - 그럼 멀티 요리의 각 잘에 배열 버퍼 1 피펫 2.0 ML. 배열 버퍼 1 블록 버퍼 역할을합니다.
평면 팁 핀셋 사용하여 4 음 다중 요리의 잘의 보호 시트와 장소 사이에서 사용되는 각 멤브레인을 제거합니다. 배열 번호는 위쪽으로 직면해야한다.
배열 버퍼 1 접촉시, 장소에서 청색 색소가 사라집니다하지만, 캡처 항체들은 특정 위치에 유지됩니다.
흔들 플랫폼에서 1 시간에 품다. 동양은 트레이, 각 배열 바위 끝은 잘에 종료하는 것을. 배열의 표면은 완전히 침수와 블록 버퍼에 포함해야합니다.
멤브레인 차단 있지만, 배열 버퍼 1 1.5 ML의 최종 볼륨에 세포 lysate의 원하는 수량을 희석.
흔들 플랫폼에 2-8 ° C에서 하루 아침에 품다. 최적의 감도가 필요하지 않은 경우 짧은 배양 시간 사용할 수 있습니다.
조심스럽게 1X 워시 버퍼의 20 ML과 개별 플라스틱 용기에 4 - 그럼 멀티 요리와 장소에서 각 멤브레인을 제거합니다. 4 - 그럼 멀티 요리는 세척 단계를 완료하는 데 사용할 수 없습니다. deionized 또는 증류수와 함께 4 - 그럼 여러 요리를 씻어 완전히 건조 시키십시오.
흔들 플랫폼 흔드는 10 분에 1X 워시 버퍼 각 멤브레인을 씻으십시오. 3 세차의 총을 두 번 반복합니다.
유리 병의 라벨에 희석 요소를 사용하여 두 1X 배열 버퍼에 반 phospho-티로신 - 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP) 감지 버퍼를 희석. 4 - 그럼 멀티 요리의 각도에 희석 솔루션의 피펫 2.0 ML.
신중은 세탁 컨테이너의 각 멤브레인을 제거합니다.막에서 분출과 희석 방지 phospho-티로신-HRP을 포함하는 4 자 다 요리에 막 돌려 초과 버퍼를 허용합니다. 뚜껑과 함께 우물을 다룹니다.
흔들 플랫폼에 상온에서 2 시간에 품다.
이전에 설명 된대로 각 배열을 씻으십시오.
중단없이 나머지 단계를 완료합니다. 신중은 세탁 컨테이너의 각 멤브레인을 제거합니다. 초과 버퍼가 흡수 종이로 하단 가장자리를 blotting하여 멤브레인의 배수 할 수 있습니다. 최대 직면하고있는 식별 번호와 플라스틱 시트 프로텍터에 각 멤브레인을 배치합니다.
준비된 Chemi 시약의 피펫 한 ML은 각 막에 고르게 섞는다. 막 당 Chemi 시약 믹스 미만의 1 ML을 사용하면 불완전 막 보도 될 수 있습니다. Chemi 시약 1과 2에 대한 몇 가지 높은 강도 chemiluminescent 시약의 대체는 시약에 따라 증가 배경이나 감소 신호 중 하나가 발생할 수 있습니다.
조심스럽게 플라스틱으로 커버시트 보호. 부드럽게 공기 방울을 부드럽게하고 Chemi 시약 믹스는 각 막의 모든 구석 구석에 골고루 분포되어 있는지 확인합니다. 1 분에 품다.
위치 종이 상단과 세포막을 포함하는 플라스틱 시트 프로텍터의 양쪽에 수건을주의 깊게 초과 Chemi 시약 믹스을 짜낸 후에 사용합니다.
상단 플라스틱 시트 프로텍터를 제거하고 신중하게 흡수 실험실 남아있는 Chemi 시약 믹스를 가릴 수있는 멤브레인의 상단에 닦아 놓여 있었다.
하단 플라스틱 시트 프로텍터에 세포막을 남겨두면, 플라스틱 랩은 부드럽게 공기 방울을 부드럽게 관리하고있는 멤브레인을 다룹니다. 멤브레인 및 시트 보호가 완전히 포장되도록 시트 수호자의 뒤로 초과 플라스틱 랩으로 감싸.
방사성 동위 원소 검출에 사용되지 않은 autoradiography 영화 카세트에 최대 직면하고있는 식별 번호와 세포막을 놓으십시오.
1-10 분 동안 코닥 BioMax 라이트 필름에 노출. 다중 노출은 recomm 아르종료되었습니다. 또한, 이미지 등의 Carestream 건강으로 chemiluminescence 호환 영상을 사용하여 수집 될 수 있습니다 이미지 역 4000MM PRO.

3. 데이터 분석

개발 영화에서 본 긍정적 인 신호를 신속하게 배열 이미지에 투명 오버레이를 배치하고이 목적 모서리에 인쇄 참조 명소 쌍으로 정렬하여 식별 할 수 있습니다. 배열에 날인 된 식별 번호는 왼쪽 측면에 배치했다한다. 컨트롤과 캡처 항체의 위치는 인간 Phospho-RTK 어레이 데이터 시트의 부록에 나열됩니다.
개발 필름에 픽셀 밀도는 같은 엡손의 완벽 V750 PRO로 전송 모드 스캐너를 사용하여 수집 할 수 있습니다.
적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 배열의 각 지점에서 픽셀 밀도를 분석 할 수있는 템플릿을 만듭니다. 호환 프로그램은 GE에서 ImageQuant 또는 ArrayVision 소프트웨어, 서양 비전 sof를 포함프로파일 배열, BioRad 수량 하나 어도비 포토샵, NIH ImageJ, 그리고 단백질 간단한 AlphaView를 프로테옴 할 특정 템플릿을 사용 tware.
Microsoft Excel과 같은 프로그램에서 조작을위한 스프레드 시트 파일에 신호 값을 보냅니다.
각 RTK를 대표하는 중복 장소 쌍의 평균 신호 (픽셀 밀도)를 확인합니다.
각 지점에서 평균 배경 신호를 뺍니다. 배열 또는 배경 값으로 부정적인 제어 장소의 명확한 영역에서 신호를 사용합니다.
샘플 사이의 RTK의 인산화 수준의 상대적 변화를 결정하기 위해 서로 다른 배열에 해당하는 신호를 비교합니다.

4. 대표 결과

이 프로토콜은 인간 Phospho-RTK 배열이 RTK의 인산화에 리간드 자극과 억제제의 효과를 차단하는 데 사용할 수 있습니다 방법을 보여줍니다. 그림 1에서 데이터는 100 NG로 치료, 치료했다 MDA-MB-453 세포에 표시됩니다5 분, 또는 알려진 ErbB 가족 억제제 전에 HRGβ1 치료에 ^8-11으로 사전 처리를위한 / ML rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1). 억제 실험 세포는 1 μM HDS 029, 200 nm의 PD 153,035, 또는 세 시간 동안 200 nm의 SFM에서 PD 158,780와 incubated되었습니다. 각 배열은 lysate 100 μg과 incubated되었습니다. 인산화의 증가는 ErbB2, ErbB3에 대한 관찰, 그리고 ErbB4 캡처 명소 HRG-β1과 치료 세포를 비교 MDA-MB-453 세포를 취급하고 있습니다. 이전 HRG-β1 부화에 세 ErbB 가족 선택적 억제제로 세포의 치료는 ErbB2의 감소, ErbB3 및 ErbB4 인산화를 일으켰습니다.

그림 2에서, 데이터는 RTK FGF의 R2를 overexpress 것으로 알려진 카토 III 셀에 표시됩니다. 실험의 집합에, 카토 III 세포는 이전에 치료 100 NG / ML rhFGF 산성 (FGF)와 1 μg / ML 헤파린, 또는 FGF R 선택적 억제제 ^12-15과 pretreated로 치료, 치료했다FGF 및 헤파린. 억제제 PD173074, PD 161,570, 그리고 PD 166,285는 1 μm의 농도에서 사용하고 혈청 무료 미디어 3 시간의 카토 III 세포와 incubated되었습니다. EGF R 및 치료 가토 III 세포에서 FGF의 R2 모두의 제정 인산화, FGF의 R2의 인산화의 증가가 있지만 FGF 치료에 관찰되었다. PD 173,074으로 세포를 잠복기, PD 161,570, 또는 PD 166,285이 FGF R2와 EGF R의 인산화를 감소하게되었습니다. 이러한 억제제는 FGF R 가족 구성원의 인산화에 영향을 미칠 알려져 있지만, 이러한 결과는 억제제의 특정 농도가이 경우에 해당 EGF R과 같은 다른 RTKs에있을 수 있습니다 효과를 모니터링하기위한 인간 Phospho-RTK 배열의 유틸리티를 보여줍니다.

그림 1
1 그림. recep의 유도와 억제유방암 세포에서 티로신 키나제 토르의 인산화. 프로테옴 프로파일 러 인간 Phospho-RTK 배열 및 해당 히스토그램 프로파일의 배열 이미지는 표시됩니다. MDA-MB-453 세포는 치료 또는 RTK 억제제는 NRG-β1/HRG-β1 치료를 다음과 처리했다. 배열은 MDA-MB-453 세포에 키나제 인산화에 억제제의 효과를 모니터링하기 위해 사용되었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2. 프로테옴 프로파일 러 인간 Phospho-RTK 배열 및 해당 히스토그램 프로필에서 유도 및 위 암 세포의 수용체 티로신 키나제 인산화의 억제. 배열 이미지가 표시됩니다. 카토 III 전지는 unt했다reated 또는 FGF 산성 및 헤파린 치료를 다음 RTK 억제제로 치료하는 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

인간 Phospho-RTK는 RTK의 인산화의 심사 변경 서양 immunoprecipitation (IP)와 같은 전통적인 방법에 경제적 빠른 대안입니다. 이 방법 사용, 42 phospho-RTKs의 상대적 수준은 MDA-MB-453 또는 카토 III 세포 lysate의 단일 샘플을 사용하여 동시에 상영되었다. 또한,이 배열 분석이 방법이 훨씬 더 시간이 효율적인 다중 IP-서부를 수행하는 것보다, 2.5 시간 체험 시간을 필요합니다. chemiluminescence 검출 방법을 채용함으로써, 일반적으로 서양 데이터를 수집하는 데 사용됩니다 어떤 외의 특수 장비가 필요 없습니다. 배열은 민감하고 리간드와 억제제 치료 모두에 의한 인산화의 변화를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 외부 대상 RTKs에 억제 선택성의 평가를 할 수 있습니다. 긍정적 조회수가 더 이러한 엘리사와 같은 양적 분석을 사용하여 평가 될 수 있습니다.

효과적으로 변경 화면에 배열을 고용하려면인산화에 주요 실험 가이드 라인 준수해야합니다. 첫째, 실험 적절한 제어 샘플을 포함해야합니다. 예를 들어, 이러한 실험에 MDA-MB-453 또는 카토 III lysates에 억제제의 효과가 같은 날에 준비 lysate 샘플에서 측정되었습니다. 같은 실험에서 수집 만이 배열 데이터는 샘플 처리의 차이, 배양 시간, pipet 기술, 또는 세탁 기술로 인해 신호의 변화를 최소화하기 위해 분석해야합니다. 캡처 항체가 병렬 동질성을 가지고 선택하지 한 이후 같은 막에 두 analytes 사이의 비교 신호 강도는 권장하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 R & D 시스템즈가 추진하는 사업

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.