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Research Article
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Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.
Duplo-strand breaks (LAP) são o DNA mais deletéria lesões uma célula pode encontrar. Se deixado sem reparos, DSBs potencial grande porto para gerar mutações e aberrações cromossômicas 1. Para evitar este trauma de catalisar a instabilidade genômica, é crucial para que as células detectam DSBs, ativar a resposta de danos no DNA (DDR), e reparar o DNA. Quando estimulado, o DDR trabalha para preservar a integridade genómica, desencadeando paragem do ciclo celular para permitir a reparação para ter lugar ou forçar a célula a apoptose. Os mecanismos predominantes de reparação de DSB de ocorrer através da extremidade não homóloga-joining (NHEJ) e homóloga recombinação reparação (HRR) (revista em 2). Há muitas proteínas cujas atividades devem ser precisamente orquestrada para a DDR para funcionar corretamente. Relata-se um método para a 2 - e 3-dimensional de visualização (D) de uma destas proteínas, 53BP1.
A proteína p53 de ligação 1 (53BP1) localiza a áreas deDSBs ligando-se a histonas modificadas 3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos 5. As modificações de histonas e recrutamento de proteínas e de outros 53BP1 DDR para locais DSB são acreditados para facilitar o rearranjo estrutural da cromatina em torno das áreas de danos e de contribuir para a reparação do ADN 6. Além da participação direta na reparação, funções adicionais têm sido descritos para 53BP1 no DDR, como regular um posto de controle intra-S, um checkpoint G2 / M, e ativar proteínas jusante DDR 7-9. Recentemente, descobriu-se que não se forma 53BP1 focos em resposta ao dano do DNA induzido durante a mitose, em vez de espera para as células antes de introduzir a localização de G1 para a vizinhança de DSBs 6. Proteínas, tais como DDR 53BP1 foram encontrados para associar com estruturas de mitose (por exemplo, cinetocoros), durante a progressão através da mitose 10.
Neste protocolo, descrevemos o uso de 2 - e 3-D imagens de células vivas para visualizara formação de focos 53BP1, em resposta ao agente danificador de ADN camptotecina (CPT), bem como o comportamento 53BP1 durante a mitose. A camptotecina é um inibidor da topoisomerase I, que provoca principalmente DSBs durante a replicação do ADN. Para conseguir isto, foi utilizado um anteriormente descrito 53BP1-mCherry proteína de fusão que consiste em fluorescente construir um domínio de proteína capaz de se ligar 53BP1 DSBs 11. Além disso, utilizou-se uma histona H2B-GFP fluorescente construir a proteína de fusão capaz de controlar a dinâmica da cromatina ao longo do ciclo celular, mas em particular durante a mitose 12. Imagens de células vivas em múltiplas dimensões é uma excelente ferramenta para aprofundar nossa compreensão da função de proteínas DDR em células eucarióticas.
A. Preparação celular
B. Configuração Microscópio e Aquisição de Imagens
Este protocolo foi desenvolvido utilizando o celular Zeiss Observer SD microscópio confocal disco giratório equipado com um Z1 AxioObserver stand, um dual-channel Yokagawa CSU-X1A 5000 unidade de disco giratório, 2 Fotometria QuantEM câmeras 512SC EMCCD, um HXP iluminador à base de fibra 120C, 4 lasers (um Lasos 100mW multi-linha Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW diodo de 405 nm, 40 mW diodo nm 561, e 30 mW diodo 635 nm), AOTF, um Pecon XL multiS1 sistema de incubação fase, a incubação Zeiss módulos (O 2 Módulo de S, CO 2 Módulo de S, S TempModule, Aquecimento Unidade XL S) e uma mo Antestorized estágio XY com uma inserção NanoScanZ Z piezo. Para minimizar a aberração esférica, enquanto as células vivas de imagem suportado num meio aquoso, um C-Apochromat 63x/1.20 água / objetivo Corr lente e Immersol Zeiss fluido de imersão W (com um índice de refracção n = 1,334) foram usados. Para 2 canais confocal imaging, um RQFT 405/488/568/647 espelho dicróico e BP525/50 (verde) e BP629/62 (vermelho) filtros de emissão foram utilizados. O software do sistema utilizado foi Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) com AV4 Multi-channel/Z/T, Imaging rápido, Fisiologia, MosaiX, Mark & Find, câmera dupla, Inside 4D, foco automático e os módulos 3-D Deconvolução.
C. Processamento e Análise de Imagem
Este protocolo foi desenvolvido usando o software Volocity (PerkinElmer). O software utilizado para adquirir estes dados (AxioVision) também tem a capacidade de processar e analisar imagens. Usuários são encorajados a utilizar o software disponível para eles, e consultar literatura apropriada quanto à sua aplicação.
D. Representante Resultados
Um exemplo de formação de focos 53BP1 em resposta a CPT é mostrado na Figura 1. As células expostas a forma CPT focos dentro de 5-10 min e manter estes focos em toda a duração de gravação. Como mostrado na Figura 2, 53BP1 dissocia a cromatina no início da mitose, a formação de uma névoa fina em torno dos cromossomas de condensação. Como telófase ocorre a mitose e chega ao fim, 53BP1 mais uma vez agregados em focos distintos. Enquanto as células HEK293 não foram expostas a CPT, que, no entanto, formada abundante, focos de reparação espontânea 53BP1 gerada por danos no ADN endógeno. Esta observação permitiu concluir que 53BP1 não formar focos durante a mitose no início, de acordo com um relatório anterior que mostra um efeito semelhante após a exposição das células à radiação ionizante e as drogas radiomimético 5.
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Figura 1. Camptotecina (10 | iM) provoca DSBs e formação de focos em 53BP1 ciclismo fibroblastos dentro de 30 minutos da adição do fármaco ao meio.
Figura 2. 53BP1 não formar focos durante a mitose até telophase/G1 em células HEK293.
Não há conflitos de interesse declarados.
Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.
Suportado em parte pela R01NS064593 e R21ES016636 (KV). Microscopia foi realizada no VCU - Departamento de Neurobiologia e Anatomia Facilidade Microscopia, suportado, em parte, com recursos do NIH-NINDS Centro núcleo concessão 5P30NS047463. O microscópio confocal disco giratório foi comprado com um prêmio NIH-NCRR (1S10RR027957).
| Produto | Companhia |
| Cultura pratos CellStar | Greiner Bio-One |
| Pratos de vidro de fundo FluroDish | Precision mundo Instruments, Inc. |
| MEM mídia | GIBCO |
| Não-aminoácidos essenciais | GIBCO |
| Aminoácidos | GIBCO |
| Vitaminas | GIBCO |
| Piruvato de sódio | Invitrogen |
| Penicilina / estreptomicina | HyClone |
| Soro Fetal Bovino | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; 19836 plasmídeo | Addgene |
| pCLNR-H2BG; 17735 plasmídeo | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Celular Zeiss Observer SD Imaging System | Zeiss |
| AxioVision (versão 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W óleo | Zeiss |
| Volocity software (versão 6.0) | PerkinElmer |
