Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Resumo

Uma técnica de imagem para monitoramento de mudanças potenciais de membrana com sub-micrômetro espacial e sub-milissegundo resolução temporal é descrito. A técnica, com base na excitação do laser de corantes sensíveis à voltagem, permite a medição de sinais em axónios e colaterais, ramos terminais axonais e dendríticas individuais espinhas dendriticas.

Resumo

Compreender as propriedades biofísicas e organização funcional dos neurônios e como eles processam a informação é fundamental para a compreensão de como o cérebro funciona. A função primária de uma célula nervosa é processar sinais eléctricos, normalmente a partir de fontes múltiplas. Propriedades eléctricas de processos neuronais são extraordinariamente complexo, dinâmico, e, no caso geral, impossível de prever na ausência de medidas pormenorizadas. Para obter tal medida um seria, idealmente, gostaria de ser capaz de monitorar, em vários sites, eventos subliminares que viajam a partir de sites de origem em processos neuronais e somam em locais específicos para a iniciação do potencial de ação. Este objectivo não foi alcançado em qualquer neurónio devido a limitações técnicas que empregam medições eléctrodos. Para ultrapassar este inconveniente, é altamente desejável para complementar a abordagem de patch-eléctrodo com técnicas de imagiologia que permitem recordin paralela extensogs de todas as partes de um neurônio. Aqui, descrevemos uma técnica como essa - de gravação óptica de transientes de potencial de membrana com orgânicas sensíveis à tensão corantes (V _m-imaging) - caracterizada por sub-milissegundo e sub-micrômetro de resolução. Nosso método é baseado no trabalho pioneiro sobre a tensão-sensíveis sondas moleculares ^2. Muitos aspectos da tecnologia inicial têm sido continuamente melhorado ao longo de várias décadas ^{3, 5, 11.} Além disso, trabalhos anteriores documentados duas características essenciais do V _m-imaging. Em primeiro lugar, os sinais de fluorescência são linearmente proporcional ao potencial de membrana ao longo de toda a gama fisiológica (-100 mV a +100 mV, ^{10, 14, 16).} Em segundo lugar, os neurónios de carga com o corante sensível a tensão usada aqui (JPW 3028) não possui efeitos farmacológicos detectáveis. O alargamento do pico registado durante o carregamento do corante é completamente reversível ^{4, 7.} Adicionalmente, a evidência experimental mostra que é possível obterum número significativo (até centenas) de gravações antes de quaisquer efeitos detectáveis ​​fototóxicas ^{4, 6, 12, 13.} No presente, aproveitar o brilho excelente e estabilidade de uma fonte de luz laser em comprimentos de onda próximo do óptimo para maximizar a sensibilidade da técnica V _m-imaging. A sensibilidade atual permite gravações local várias ópticas de transientes V _m de todas as partes de um neurônio, incluindo axônios e colaterais dos axônios, ramos dendríticas terminais, e as espinhas dendríticas individuais. A informação adquirida sobre as interacções de sinal pode ser analisado quantitativamente, bem como directamente visualizados sob a forma de um filme.

Protocolo

1. Instalação do equipamento

Passo 1.1. Configuração de imagem

A chave para a gravação de sinais de tensão corantes sensíveis é o projeto de instalação adequado. Nós usamos um microscópio vertical (BX51WI Olympus ou Zeiss AxioExaminer) equipado com três câmeras. A configuração é projetado para iluminar os neurônios individuais em fatias de cérebro de luz de excitação em epi-fluorescência, de campo amplo modo de microscopia usando tanto Nikon 60X/1.0 NA ou Zeiss 63X/1.0 água NA objetivos de imersão. Os nossos microscópios são aparafusadas a uma mesa de isolamento de vibrações e equipado com fases móveis motorizados. Cada microscópio é equipado com três portas da câmara. Uma porta de câmara tem um alto padrão de resolução espacial da câmara CCD para DIC infravermelhos microscopia vídeo-(IR-1000, Dage MTI, EUA). A porta da câmera segundo tem uma câmera rápida aquisição de dados (até 20 kHz taxa de quadros), com relativamente baixa resolução espacial (80 x 80 pixels), mas a gama dinâmica excepcional (14 bits) e excepcionalmente baixo lerruído (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). A porta da câmara terceiro tem uma câmara CCD com uma elevada resolução espacial (PixelFly, 1392x1024 pixels; PCO AG, Alemanha), montado sobre um digitalizador de fiação discos confocal (CSU-10, Yokogawa, Japão) utilizado para recolher z pilhas de imagens confocais de reconstrução morfológica detalhada da célula corada. Um diodo de frequência duplicada Nd: YVO4 laser de onda contínua (400 mW) emitindo a 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, China) é a fonte de luz de excitação. O feixe de laser de 2 milímetros de diâmetro fechado por um obturador (LS6; Vincent Associates) é dirigido a um guia de luz, acoplado ao microscópio de epifluorescência, através de um condensador de porta única (ATÉ Photonics GmbH, Gräfelfing, Alemanha), concebido para sobrecarregue a abertura traseira do objetivo e proporcionar iluminação uniforme perto do avião objeto. A luz laser é usado em lugar de um arco de xénon lâmpada convencional para maximizar a sensibilidade do V _{m-imagiologia} por: (1) utilizando um ex monocromáticaluz citação na asa do vermelho do espectro de absorção para maximizar a sensibilidade _m V do corante ^{9, 10} e (2) o aumento da intensidade da luz de excitação para além do nível que pode ser alcançado por uma lâmpada de arco. A luz de excitação foi reflectida para a preparação de um espelho dicróico com um comprimento de onda central de 560 nm e a luz de fluorescência foi registada passados ​​através de um filtro de barreira de 610 nm (a Schott RG610). O efeito combinado de um aumento da intensidade de luz e o uso de comprimentos de onda de excitação ideal perto monocromáticas foi uma melhoria dramática na sensibilidade da imagem por um factor de tensão de cerca de 50 em comparação com as medições anteriores ^6.

Passo 1.2. Ajuste para iluminação uniforme

Use um padrão de slides de fluorescência (excitação verde / emissão vermelha). Inserir apropriados filtros de densidade neutra no caminho do feixe de laser de modo a que o CCD não está saturado. Concentre o objectivo na superfícieo slide. Ajustar a posição da extremidade de recepção da guia de luz de quartzo em frente da objectiva lançador laser, e ajustar a posição da extremidade de saída do guia de luz ligado a um microscópio usando actuadores apropriados no condensador de epi-fluorescência para alcançar centrado e uniforme iluminação do campo de visão.

Passo 1.3. Determine ruído vibracional

Colocar uma marca de tinta preta pequena na superfície da lâmina de fluorescência. Intensidade de luz com registro NeuroCCD no modo de gravação contínua. Concentre-se o objetivo em uma borda escura da marca de tinta preta. Registrar a intensidade da luz por cerca de 100 ms a 2 kHz taxa de quadros. Exibir a média espacial dos vestígios de luz de intensidade fraccionada (Af / F) de ~ 20 pixels que recebem luz a partir da superfície iluminada de maneira uniforme e de ~ 20 pixels ao longo da borda da marca de tinta. O excesso de ruído em gravações de pixels com bordas de alto contraste reflete o ruído vibracional emo sistema.

Passo 1.4. Isolamento de vibração

É obrigatório para reduzir as vibrações, usando uma mesa de vibração isolamento para um nível abaixo do ruído de disparo em intensidades de luz comparáveis ​​às condições de gravação experimentais. Ajustar a mesa de isolamento de vibrações até que o ruído de vibração na intensidade de luz a partir de pixels que cobrem a ponta afiada da imagem é desprezível. Nenhum dos equipamentos com peças móveis (obturadores mecânicos, ventiladores) pode ser montado em cima da mesa. Os cabos do equipamento na tabela ligada a outros componentes que não são isolados da vibração devem ser soltos, de modo que eles não transmitem vibrações mecânicas ao microscópio.

2. Seleção de um Neurônio apropriado para V _m-Imaging

Passo 2.1. Selecção dos neurónios

Fazer fatias de cérebro de acordo com os procedimentos padrão. Use uma linha de rato expressando EGFP em células nervosas individuais de interest. Com um sistema de disco giratório confocal, visualizar neurônios EGFP rotulados na fatia. Seleccione neurónios para V _m-imagem com intactas dendríticas / axonal árvores, e com os processos de execução paralela e próxima da superfície da fatia. Isto não pode ser realizado em ratinhos de tipo selvagem porque axónios e dendritos ligeiros, para a maior parte, não são visíveis no modo de microscopia DIC.

3. Neurônios de carregamento com tensão sensível Dye

Passo 3.1. Enchimento da pipeta de patch

Encher pipetas de vidro de patch a partir da ponta com o corante isento de solução intracelular através da aplicação de uma pressão negativa durante cerca de 15 s até 2/3 do atarraxamento do eléctrodo. A solução de corante livre na ponta é necessária para impedir o derrame de corante sobre a fatia que aumenta a fluorescência de fundo e reduz dramaticamente a relação sinal-ruído. Back-encher o eléctrodo com a solução contendo o corante de membrana de tensão impermeante sensível JPW3028 dissolvidoem solução intracelular (0,8 mM).

JPW3028, a ponta de voltagem de maior sucesso para aplicação intracelular, é um análogo duplamente carregado positivamente da série de ANEP lipofílicos corantes de estirilo, que ainda é suficientemente solúvel em água para ser utilizada para microinjecção. O análogo de di-etilo deste corante tem praticamente idênticas características (incluindo tensão sensibilidade) e está disponível comercialmente como JPW1114 (ver Tabela 1). Nós preparamos 20 mM solução estoque em água destilada H ₂ O. Alíquotas de 50 ul da solução de estoque foram mantidas congeladas a -20 ° C. Para a concentração de corante final de 0,8 mM, 2 ul de solução-mãe é dissolvido em 50 ul de solução intracelular no dia da experiência. A solução de corante estoque é estável e pode ser guardado à temperatura ambiente durante vários meses. Assim, manter uma alíquota de 50 ul, à temperatura ambiente até ser utilizado.

Passo 3.2. Estabelecer um giga-selo rapidamente

Patch um neurônio previamente selecionados e permitir a livre difusão do corante de uma pipeta de patch somática para a soma de toda a configuração de célula de 20-45 min. É essencial para se obter uma vedação tão rápido quanto possível, de modo que a quantidade de corante livre em solução a ponta pode ser mantido pequeno. Comece praticando patching rápido sem o corante no eléctrodo. Neurónios patching prática seguinte, e carregar com o corante, com o objectivo de usar uma quantidade mínima de corante livre em solução da ponta, sem contaminar o tecido circundante. Com a prática, é possível estabelecer uma vedação dentro de 1-2 min.

Passo 3.3. Monitorar o nível de coloração

Durante a difusão do corante na configuração de célula inteira, monitorar o estado fisiológico do neurónio através da gravação dos potenciais evocados acção no modo de fixação de corrente. Além disso, controlar a quantidade de coloração por registo da intensidade da luz de repouso (RLI) a partir da soma das células com uma taxa de fotogramas de 2 k Hz e a uma fracção da intensidade de luz total ajustado com filtros de densidade neutra (usamos 0,04% da intensidade de luz de laser a partir de um laser de 400 mW). Continuar o processo de carregamento de corante até que o potencial de acção inicia a ampliar, geralmente após 20-40 minutos, dependendo do tamanho e da resistência do eléctrodo.

O alargamento do pico é completamente reversível e, provavelmente, devido ao efeito de carga capacitiva da concentração saturada do corante na membrana somática. A forma de onda do pico é totalmente restabelecida após a concentração do corante é equilibrada durante todo o neurónio.

Passo 3.4. Remover o eléctrodo de corante

No final do período de coloração, puxar cuidadosamente a pipeta patch de distância da soma na configuração de fixação de tensão assegurando que a passagem de células inteiras para fora para fora configuração remendo é alcançado no processo.

Passo 3.5. Aguarde para a difusão de corante

ent "> Incubar a fatia por um 1,5-2 h adicionais à temperatura ambiente para permitir que o corante sensível à tensão de espalhar em processos neuronais. Depois de uma quantidade significativa de corante difunde-se para longe a partir da soma em processos dendríticos e axonal, a forma de onda de o AP é completamente restaurado.

4. A gravação óptica

Passo 4.1. Seleccionar um compartimento celular para imagiologia

Localize a soma do neurônio manchado sob fluorescência baixo nível de luz e re-patch do neurônio com um eletrodo patch padrão (sem corante) em DIC. Visualize processos neuronais em nível baixo de luz em uma taxa de quadros de 10-40 Hz no modo de gravação contínua do CCD para a tensão de imagem. Reduzir o nível de luz com filtros de densidade neutra para o mínimo necessário para visualizar o objeto de interesse. Usamos a 0,01% da intensidade do laser 400 mW durante o posicionamento do neurónio manchado. Utilizando uma fase XY, posicionar o processo neuronal de interesse em tele meio da área de imagem. Proteger a soma da luz de excitação através da íris paragem parcialmente fechada campo do microscópio. Protegendo a soma de luz de alta intensidade de excitação vai reduzir significativamente os danos fotodinâmica durante a gravação.

Passo 4,2 sinais ópticos Grave relacionados com potenciais de membrana transientes

Gravar sinais ópticos relacionados com APs backpropagated em ramos individuais dendríticas. Gravar sinais ópticos relacionados com APs no axônio. Gravar sinais ópticos relacionados com backpropagating APs em espinhas dendríticas. Usar taxas de quadros adequadas para a reconstrução exata da forma de onda do sinal e manter os períodos de gravação e exposição a luz de alta intensidade de excitação tão curtos quanto possível para minimizar corante branqueamento e danos fotodinâmica. Por exemplo, a análise da sequência de iniciação e propagação de potenciais de acção simples em que o axônio requer períodos de gravação de mseg 5-10. A excitação de luz intensificadaty durante a gravação é um compromisso entre a relação sinal-ruído de um lado e do grau de branqueamento e corante dano fotodinâmico, por outro lado. Usamos 100% de intensidade de laser de 400 mW no modo de gravação a partir de secções longas de axônios quando uma área de 300 m de diâmetro é iluminado. Quando a luz de excitação é focada para uma área de 30 um de diâmetro para imagiologia espinha dendrítica, usamos 10-25% da intensidade da luz laser. A duração necessária de gravação é um importante determinante da intensidade ideal de excitação luz; períodos mais curtos de gravação permitem maior intensidade de luz. A intensidade da iluminação óptima é melhor determinado empiricamente para cada preparação e de medição.

5. Análise de Dados

Passo 5.1. Corrigir os dados brutos para erros conhecidos

A análise e exibição dos dados foram realizados utilizando o programa NeuroPlex (RedShirtImaging) escrito em IDL (ITT Informação Visual solutíons, em Boulder, Colorado) e personalizados Visual rotinas básicas. Sob as condições de baixa luminosidade, a fluorescência de fundo torna-se um determinante significativa do tamanho do sinal Af / F. Os dados brutos foram primeiro corrigido para este efeito por subtracção da intensidade de fluorescência média de fundo determinado a partir de uma área não corada da fatia. Subsequentemente, o software de alinhamento de sinal foi utilizado para corrigir jitter temporal em AP iniciação, bem como possíveis para pequenos movimentos da preparação durante o cálculo da média. No domínio temporal, os sinais de AP foram alinhadas por meio da correlação cruzada dos APs electricamente gravado em cada ensaio para o sinal de referência adquirido no início da média (Figura 1B). No domínio espacial, as imagens foram alinhados em duas dimensões desligada por imagem de correlação cruzada para compensar eventuais pequenos movimentos laterais da preparação. O foco correto da imagem no z-dimensão foi verificado antes de cada prova individual; smal l ajustes eram muitas vezes necessário. Os sinais espacialmente e temporalmente alinhados foram calculados como se mostra na Figura 1B. Mudanças lentas na intensidade da luz devido a descoloração do corante foram corrigidos dividindo os dados por uma função exponencial dupla apropriado derivado de ensaios de gravação sem estimulação (Figura 1B). A forma de onda do sinal de AP foi reconstruída a partir de um conjunto de pontos de dados usando Cubic Spline interpolação, uma curva contínua por partes que passa através de cada ponto de dados. Para confirmar que o sinal de tensão de corante sensível ao potencial de membrana controla sem distorção significativa na escala de tempo de milisegundos, o sinal eléctrico a partir do AP soma foi comparado com o sinal óptico a partir do AP hillock do axónio adjacentes, como mostrado na Figura 3B. Os dois sinais sobrepostos de muito perto, o que permite o disparo de ruído de gravação óptica.

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Figura 1. Análise de dados (Animação). (A) Painel superior: imagem confocal de alta resolução de um neurônio com axônio manchado na posição de gravação. Eléctrodo de registo ligado a soma e eléctrodo estimulante extracelular ao lado dendrito basal mostrado esquematicamente. Os potenciais de acção evocado por estimulação extracelular sináptica. Painel inferior: imagem de baixa resolução espacial de fluorescência do axônio obtidos por CCD usado para V _m de imagem (B) Eletrodo gravações de soma (traços pretos), gravações ópticas de AIS (traços vermelhos), e do nó de Ranvier (traços verdes). . Traços principais: dados brutos de nove ensaios que mostram jitter temporal na AP iniciação. Segunda fila de traços: temporalmente alinhado sinais. Terceira fila de traços: sinal de média. Quarta linha de traços: correção de lixívia. Traços de fundo: interpolação spline cúbica com um passe de suavização temporal.

Resultados

A microscopia confocal de sucesso deve permitir uma identificação clara de processos neuronais intactos que estão perto da superfície da fatia e localizado num plano de foco. A selecção de células nervosas que sejam adequados para a imagiologia de tensão antes de sensíveis à voltagem de carga de corante é crítica. Um exemplo de imagens confocais de L5 neurónios piramidais expressando EGFP em uma fatia cortical (Crym linha transgénica mouse) é mostrado na Figura 2. Axônios dos neurônios individuais são c...

Discussão

Este artigo descreve uma tensão sensível ao método de gravação de corante para monitorar a atividade elétrica dos neurônios individuais com submicrométrica e sub-milissegundo resolução espaço-temporal. A excitação por laser no comprimento de onda próximo do ideal (em termos de dimensão do sinal) melhorou a sensibilidade da gravação por um fator de ~ 50 sobre as abordagens anteriores. A sensibilidade de corrente permite a monitorização de sinais eléctricos a partir de todas as partes de neurónios individuais, incluindo o...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do componente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
			Componentes de instalação
Microscópio vertical	Olympus Inc.	BX51WI	Com três portas da câmara
Palco móvel motorizado	Siskiyou	MXOPi.2
Epi-fluorescência Condensador para Olympus BX51	ATÉ Photonics	0000-560-11659
Microscópio vertical	Carl Zeiss, LLC	D1 AxioExaminer	Com três portas da câmara
Motorizada Placa Superior	Scientifica limitada	MMBP
Epi-fluorescência Condensador para Zeiss AxioExaminer	ATÉ Photonics
Dados da câmara de Aquisição	RedShirtImaging LLC	NeuroCCD-SM	De alta velocidade, baixo ruído de leitura
CCD para IR-DIC	Dage-MTI	IR-1000
Spinning-Disco Scanner Confocal	Yokogawa	CSU-10
CCD de alta resolução espacial no Scanner Confocal	PCO AG	PixelFly	1392x1024 pixels
CW DPSS Laser (532 Nm)	CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd	MLL-III-532 400mW	Fonte de luz de excitação
Multi-Modo de fibra Lançador	Siskiyou	SM-CFT
Guia de luz	ATÉ Fotonics	0000-515-11524
Persiana	Vincent Associates	LS6
Mesa de isolamento de vibração	Menos k Tecnologia	MK26
			Reagentes específicos
Di-2-ANEPEQ (JPW 1114)	Life Technologies	D-6923	Corante sensível tensão
Crym-EGFP Linha Rato	GENSAT (MMRRC)	STOCK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd	Esparsamente expressando EGFP na camada 5 neurônios corticais