Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Marko Popovic; Xin Gao; Dejan Zecevic

doi:10.3791/4261

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Artigo de método

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

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DOI:

10.3791/4261

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29 de novembro de 2012

Marko Popovic¹ , Xin Gao¹ , Dejan Zecevic¹

¹Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Uma técnica de imagem para monitoramento de mudanças potenciais de membrana com sub-micrômetro espacial e sub-milissegundo resolução temporal é descrito. A técnica, com base na excitação do laser de corantes sensíveis à voltagem, permite a medição de sinais em axónios e colaterais, ramos terminais axonais e dendríticas individuais espinhas dendriticas.

Resumo

Compreender as propriedades biofísicas e organização funcional dos neurônios e como eles processam a informação é fundamental para a compreensão de como o cérebro funciona. A função primária de uma célula nervosa é processar sinais eléctricos, normalmente a partir de fontes múltiplas. Propriedades eléctricas de processos neuronais são extraordinariamente complexo, dinâmico, e, no caso geral, impossível de prever na ausência de medidas pormenorizadas. Para obter tal medida um seria, idealmente, gostaria de ser capaz de monitorar, em vários sites, eventos subliminares que viajam a partir de sites de origem em processos neuronais e somam em locais específicos para a iniciação do potencial de ação. Este objectivo não foi alcançado em qualquer neurónio devido a limitações técnicas que empregam medições eléctrodos. Para ultrapassar este inconveniente, é altamente desejável para complementar a abordagem de patch-eléctrodo com técnicas de imagiologia que permitem recordin paralela extensogs de todas as partes de um neurônio. Aqui, descrevemos uma técnica como essa - de gravação óptica de transientes de potencial de membrana com orgânicas sensíveis à tensão corantes (V _m-imaging) - caracterizada por sub-milissegundo e sub-micrômetro de resolução. Nosso método é baseado no trabalho pioneiro sobre a tensão-sensíveis sondas moleculares ^2. Muitos aspectos da tecnologia inicial têm sido continuamente melhorado ao longo de várias décadas ^{3, 5, 11.} Além disso, trabalhos anteriores documentados duas características essenciais do V _m-imaging. Em primeiro lugar, os sinais de fluorescência são linearmente proporcional ao potencial de membrana ao longo de toda a gama fisiológica (-100 mV a +100 mV, ^{10, 14, 16).} Em segundo lugar, os neurónios de carga com o corante sensível a tensão usada aqui (JPW 3028) não possui efeitos farmacológicos detectáveis. O alargamento do pico registado durante o carregamento do corante é completamente reversível ^{4, 7.} Adicionalmente, a evidência experimental mostra que é possível obterum número significativo (até centenas) de gravações antes de quaisquer efeitos detectáveis fototóxicas ^{4, 6, 12, 13.} No presente, aproveitar o brilho excelente e estabilidade de uma fonte de luz laser em comprimentos de onda próximo do óptimo para maximizar a sensibilidade da técnica V _m-imaging. A sensibilidade atual permite gravações local várias ópticas de transientes V _m de todas as partes de um neurônio, incluindo axônios e colaterais dos axônios, ramos dendríticas terminais, e as espinhas dendríticas individuais. A informação adquirida sobre as interacções de sinal pode ser analisado quantitativamente, bem como directamente visualizados sob a forma de um filme.

Protocolo

1. Instalação do equipamento

Passo 1.1. Configuração de imagem

A chave para a gravação de sinais de tensão corantes sensíveis é o projeto de instalação adequado. Nós usamos um microscópio vertical (BX51WI Olympus ou Zeiss AxioExaminer) equipado com três câmeras. A configuração é projetado para iluminar os neurônios individuais em fatias de cérebro de luz de excitação em epi-fluorescência, de campo amplo modo de microscopia usando tanto Nikon 60X/1.0 NA ou Zeiss 63X/1.0 água NA objetivos de imersão. Os nossos microscópios são aparafusadas a uma mesa de isolamento de vibrações e equipado com fases móveis motorizados.....