Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Resumo

Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Resumo

Os protocolos existentes para a produção de neurónios de células pluripotentes humanas estaminais (hPSCs) são muitas vezes entediantes em que se trate de processos com vários passos, envolvendo o isolamento e expansão de células precursoras neurais, antes da diferenciação terminal. Em comparação com estas abordagens demorados, que têm encontrado recentemente que a inibição combinada de três vias de sinalização, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 e FGF / ERK, promove a rápida indução de neuroectoderme de hPSCs, seguido de imediato de diferenciação em neurónios funcionais. Aqui, nós adaptamos o nosso procedimento para um formato de romance placa multititre, para aumentar ainda mais a sua reprodutibilidade e para torná-lo compatível com o meio-throughput de aplicativos. Ele compreende quatro dias de formação neuroectoderme em esferas flutuantes (corpos embrióides), seguido por mais quatro dias de diferenciação em neurónios em condições de aderência. A maioria das células obtidas com este protocolo parecem ser os neurônios sensoriais bipolares. Além disso,o processo é altamente eficiente, não requer conhecimentos especializados particulares, e baseia-se em um meio simples quimicamente definido, com boa relação custo-eficiência moléculas pequenas. Devido a estas características, o procedimento pode servir como uma plataforma útil para investigação funcional adicional, bem como para a célula baseada em triagem aproxima exigindo humanos neurónios sensoriais ou neurónios de qualquer tipo.

Introdução

hPSCs, compreendendo embrião derivado de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs), são pluripotentes sentido de que eles podem dar origem a linhagens de células diferentes in vitro ^1-2. Vários tipos de células diferenciadas foram derivados de hESCs até à data, apoiar a noção de que essas células apresentam ferramentas valiosas para a pesquisa científica e as abordagens baseadas em células de triagem, e uma promessa para a célula-base terapêutica.

Protocolos para a diferenciação neuronal hESCs são geralmente complexo e demorado uma vez que são muitas vezes baseados na primeira indução destino global neural, seguido por isolamento manual das células progenitoras neurais, e subsequente diferenciação terminal em um tipo de dado de interesse neurónio ^3-6. Em alguns respeito, essa complexidade não é surpreendente e inevitável, dado que tal estado-da-arte protocolos de diferenciação direcionadas tendem a imitar gradual desenvolvimento humano precoce, which é em si extremamente complexo. Por outro lado, pode, em parte, também reflectem a falta de compreensão dos processos moleculares subjacentes, o que resulta em protocolos de diferenciação que ainda estão longe de ser totalmente otimizado.

No que se refere à conversão de hPSCs indiferenciadas em neuroectoderme, Pera et al. descobriu que a supressão de BMP / SMAD1/5/8 sinalização aumenta a indução neural de hESCs ^7. Além disso, a inactivação de Smad2 / 3 de sinalização tem sido mostrado para promover a formação de neuroectoderme ^8. Por conseguinte, a inactivação combinado destas duas vias tende a levar a mais eficiente de indução neural hPSCs ^4,9. Mais recentemente, têm demonstrado que a via de sinalização do terceiro, FGF / ERK, serve como um repressor forte dos primeiros passos de compromisso neuroectodérmica em hESCs. Inversamente, a repressão simultânea de todos estes três vias levam a quase homogénea conversão de hESCs em neuroectoderme comem apenas quatro dias ^10. Posteriormente, a diferenciação terminal altamente eficiente em neurônios funcionais foi observado no prazo de oito dias. Os neurônios obtidos eram susceptíveis de ser neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico, o que pode, em parte, explicar a sua derivação rápida ^10. Defeitos na manutenção neurônio sensorial é considerada uma causa de certas doenças humanas, tais como disautonomia familiar ^11. Para a modelagem de tais doenças baseadas em tecnologia hiPSC ^12, para a caracterização funcional adicional, bem como para fins de aplicação não exigem qualquer tipo específico de neurónios, este processo de diferenciação podem apresentar uma base útil.

No entanto, a estratégia de diferenciação que originalmente empregado envolvido formação de corpos embrionárias (EBS) de touceiras de colônias CTEh ^10, e isso resultou em um bom grau de heterogeneidade em relação a tamanhos EB, e também apareceu para comprometer neurônio eficiência de formação em algumas celinhas ll. Por outro lado, devido à heterogeneidade nos tamanhos EB, a capacidade para testar sistematicamente os efeitos de factores de crescimento adicionais ou pequenas moléculas, durante e depois da formação de neurónios parecia ser um pouco confusa.

Neste relatório, nós adaptamos o nosso procedimento anterior para um meio de rendimento compatível, forçado técnica de agregação baseado gerar EBs de uma forma altamente tamanho controlado, como também mostrado em outros contextos ^13. Subsequentemente, o EBs gerada em forma de V poços de placas de 96 poços foram transferidas para fixação em forma de U de ultra-baixo de 96 poços, para iniciar a formação de neuroectoderme em suspensão. Quatro dias mais tarde, o EBs pode ser plaqueada para fora dando origem a neurónios terminalmente diferenciadas em alto rendimento e homogeneidade. Alternativamente, 4 dias de EBs foram dissociadas em células isoladas e plaqueadas como tal, o que resultou em baixa densidade monocamadas de neurônios humanos. Os resultados foram coerentes até agora obtida com os dois independentemente deRIVED linhas CTEh, HuES6 e NCl3.

Como pré-requisito, a formação de EB sucesso era estritamente dependente da utilização de um polímero sintético, álcool polivinílico (PVA), em conjunto com o inibidor ROCHA Y-27632 conhecido para promover a sobrevivência hESC ^13-14. Como resultado, a homogeneidade da EBs formado em 96-V-placas foi substancialmente melhorada em comparação com a formação de EBs como culturas em massa com base em técnicas de separação aleatórios. Este sistema proporciona assim uma plataforma significativamente melhorada para a formação de neuroectoderme em cultura em suspensão, seguindo-se a formação de neurónios em condições altamente controlado aderentes.

Protocolo

1. Preparação de Matrigel revestidos Pratos e Mídia

1. Preparação de Matrigel revestido Matrigel placas foi encontrado para ser um substrato preferido para a ligação de diferenciação EBs e também promove o crescimento eficiente dos neurónios a partir destes ^10.
   1. Ml degelo 10 de Matrigel durante a noite em gelo.
   2. No dia seguinte, diluir a Matrigel gelatinosa com dois volumes de gelado DMEM/F-12 e preparar alíquotas de 1 ml em 15 ml previamente arrefecido de tubos cónicos que podem ser armazenados congelados a -20 ° C.
   3. Decidir sobre um formato de placa para a diferenciação neuronal. Por exemplo, como ponto de partida, recomendamos realizar uma rodada inicial de diferenciação em um formato de 12 poços. Pré-cool quatro placas de 12 poços a 4 ° C. Dissolver uma alíquota de Matrigel congelada através da adição de 9 ml de pré-resfriada DMEM/F-12 seguido por pipetagem para cima e para baixo até que todo o pré-diluído Matrigel foi descongelado e dissolvido.
   4. Depois, Transferir o conteúdo para um tubo de 50 ml novo, contendo 15 ml de DMEM/F-12 em gelo (Matrigel diluição final: 1:75). Em seguida, adicionar 0,5 mL de Matrigel diluído a cada poço das pré-arrefecidos placas de 12 poços. Enrole placas com Parafilm e deixe descansar em temperatura ambiente durante a noite.
   5. No dia seguinte, placas de transferir a 4 ° C. Placas revestidas podem ser armazenadas durante várias semanas antes de usar.
2. Mídia

EB meio de formação (~ 15 ml necessário para realizar a diferenciação de uma placa de 96 cavidades - ver Quadro 1 e esquema da Figura 2):
DMEM/F-12 com 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% de BSA
20 ng / ml FGF2
10 uM Y-27632
1x PenStrepGln

Meio de diferenciação (~ 30 ml necessário para realizar a diferenciação de uma placa de 96 poços, seguindo-se a formação de um neurónio Matrigel revestido placa de 12 poços, ver Quadro 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0,05% de BSA
0,5 uM PD0325901
15 SB431542 fiM
0,5 mM Dorsomorphin
1x PenStrepGln

2. Formação EB forçado

1. HPSCs crescer sob seus preferidos alimentador sem condições. Usamos MEF meio condicionado em Matrigel revestidas placas de 6 poços ^15. No entanto, sistemas de cultura, tais como caseiros ou comerciais de mídia definidos também deve funcionar. No momento de iniciar a experiência, diferenciação hPSCs deve ser sub-confluente e em crescimento activo.
2. Remover mecanicamente espontaneamente colônias diferenciadas com uma ponta de pipeta estéril de plástico sob um microscópio estéreo.
3. Lavar restantes colónias indiferenciadas utilizando PBS, e as células individuais de digest utilizando Accutase contendo 1X Y-27632. Células individuais pelotas por centrifugação a 200 xg durante 2 min, ressuspender em um pequeno volume de meio de formação de EB e determinar titre célula usando um hematocytometer.
4. Adicionar uma parte alíquota de células parao meio de formação restantes EB para resultar em um título entre 40.000 e 80.000 células por ml.
5. Utilizando uma pipeta de canais múltiplos, transferir 100 ul por poço de uma placa de fundo 96V, resultando em 4.000 a 8.000 células por poço. Placa de 96 poços de centrifugação numa centrífuga de placa swing-out a 400 xg durante 1 min para recolher as células no fundo dos poços, e transferir para a cultura de células de incubadora. EBs irá formar durante a noite, como mostrado na Figura 1.

3. Indução neuroectoderma

1. No dia seguinte (dia 0), a partir de chapa de recolher EBs 96V sob um microscópio estéreo e transferência para um pequeno volume numa placa de 3,5 centímetros bacteriana contendo 2 ml de meio de diferenciação. Agite suavemente o prato por vários segundos para lavar a EBS.
2. Adicionam-se 100 ul de meio por poço a diferenciação de um ultra-low-fixação fundo em U de 96 poços da placa. Sob estereomicroscópio, transferência EBs em pequenos volumes a partir da lavagem do prato para o 96U-poços (um EB por nósll). Colocar a placa de cultura de células em 96U incubadora durante 4 dias, para permitir a formação de neuroectoderme.

4. Formação neurônio

1. No dia 4, preparar um prato de lavagem como descrito no passo 3.1 e, adicionalmente, substitua DMEM/F-12 num pré-aquecido Matrigel revestido placa de 12 poços por meio de diferenciação (1 ml por poço).
2. Chapeamento de EBs
   1. Recolha de EBs placa 96U, lavar estas sementes como acima, e cuidadosamente uma por uma nos poços do Matrigel revestido placa de 12 poços (cerca de 8 EBs por poço): EBs deve ser igualmente distribuído dentro dos poços para permitir outgrowth imperturbada do neurônios ao longo dos próximos dias (ver "dia 5" imagem na Figura 2).
   2. Antes da transferência da parte de trás da placa de 12 poços na incubadora, permitir EBs para anexar livremente por cerca de 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, transferir cuidadosamente placa de 12 poços para cultura de células de incubadora. Neurónios vai crescer para fora da EBs chapeado de um modo radial dentro dos 4 dias seguintes, tal como shown na Figura 2 ("dia 8" imagem à direita).

5. Neurônio Formação como monocamadas

1. Como uma alternativa para os passos do ponto 4), no dia 4 do procedimento, recolher EBs em um prato de 3,5 centímetros bacteriana contendo 2 ml de meio de diferenciação, em seguida, transferir EBs em um pequeno volume para um prato de PBS contendo, em seguida, em outro prato contendo Accutase.
2. Deixe digerir a células individuais, centrifugar a 200 xg durante 2 minutos, ressuspender em um pequeno volume de meio de diferenciação e determinar titre célula usando um hematocytometer. Ajustar a título de 1-2x10 ⁶ células por ml em meio de cultura de diferenciação (sem Y-27632).
3. Células da placa para fora na pré-aquecido Matrigel revestido placa de 12 poços (1 mL por cavidade), e transferência para a incubadora de cultura de células. Formação Neuron como monocamadas foram observadas entre os dias 7-8 (Figura 3C). Deve notar-se, contudo, que esta variante de monocamadao processo não está completamente optimizada no que se refere à sobrevivência das células e substrato mais adequado.

Resultados

Em nosso relatório anterior, em linha com muitos outros, a partir de EBs hPSCs poderiam ser gerados pela simples repique agregados, com a divisão de rotina de hPSCs em fixação de baixa pratos ^10. Isso geralmente resulta em uma ampla distribuição de tamanhos EB resultantes (Figura 1C, superior). Outro problema resultante da presente é a de que EBs mantidas em suspensão tendem a agregar uma com a outra, conduzindo a uma ainda maior heterogeneidade de tamanhos de EB. Para contornar esses problem...

Discussão

A maioria dos protocolos de diferenciação que envolvem a formação de EB hPSCs, incluindo o nosso procedimento publicado anteriormente ^10, baseiam-se manual ou enzima-assisted colheita de hESCs como agregados, o que conduz inevitavelmente a heterogeneidade nos tamanhos de EB. Este fato leva à variabilidade na eficiência de diferenciação com algumas linhas de células, tornando análises sistemáticas difícil, em particular, em uma escala rendimento médio. Além disso, o esvaziamento manual é de trabalho intensivo ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	Ver texto para detalhes sobre o tratamento
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poli (álcool vinílico)	Sigma	363170	Dissolver em 0,4% em DMEM/F-12 usando um banho de água de ultra-sons / evitar sobreaquecimento / pode ser mantida a 4 ° C durante várias semanas
Suplemento N2	Life Technologies	17502-048	100X, armazenar como alíquotas congeladas
B27 Suplemento	Life Technologies	12587-010	Loja, 50X como alíquotas congeladas
Albumina de Soro Bovino	Sigma	A1595	10% = 500X, loja como alíquotas congeladas
L-Glutamina com Penicilina / Estreptomicina	PAA	P11-013	Ou equivalente
FGF2	Peprotech	100-18B	Dissolver a 10 ug / ml em 0,1% BSA / PBS = loja, 1000X como alíquotas congeladas
ROCHA inibidor Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Dissolver em 10 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas
PBS	PAA	H15-002	Ou equivalente
Accutase	PAA	L11-007
De 96 poços de fundo em V placas	Nunc	277143
PD0325901	Axon medchem	Axon 1408	Dissolver a 0,5 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	dissolver em 15 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	dissolver a 0,5 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas
De 96 poços com fundo em U de ultra baixa placas de fixação	Corning	7007
beta-tubulina III anticorpo (mouse)	Sigma	T8660	usar em 1:1000
beta-tubulina III anticorpo (coelho)	Covance	PRB-435P	usar em 1:2000
BRN3A anticorpo (POU4F1)	Santa Cruz	sc-8429	usar de 1:500
			Tabela 1. </ Strong> reagentes e equipamentos específicos.