Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

Resumo

Aqui, apresentamos um método para a troca fotoativada de proteínas fluorescentes fotoconversíveis (PCFPs) no embrião vivo de peixe-zebra e rastreamento adicional de proteína fotoconvertida em pontos de tempo específicos durante o desenvolvimento. Esta metodologia permite o monitoramento de eventos biológicos celulares subjacentes a diferentes processos de desenvolvimento em um organismo vertebrado vivo.

Resumo

A embriogênese é um processo dinâmico que é melhor estudado usando técnicas que permitem a documentação de mudanças de desenvolvimento in vivo. O uso de proteínas fluorescentes geneticamente codificadas provou ser uma estratégia valiosa para elucidar processos morfogenéticos dinâmicos à medida que ocorrem no organismo intacto. Durante a última década, o desenvolvimento de proteínas fluorescentes fotoativáveis e fotoconversíveis abriu a possibilidade de investigar o destino de subpopulações discretas de proteínas marcadas¹. Ao contrário das proteínas fotoativáveis, as proteínas fluorescentes fotoconversíveis (PCFPs) são prontamente rastreadas e visualizadas em seu estado de emissão nativo antes da fotoconversão, facilitando a identificação e seleção de regiões por inspeção óptica. Os PCFPs, como Kaede², KikGR³, Dendra⁴ e EosFP⁵, podem ser deslocados de verde para vermelho após exposição à luz UV ou azul devido a uma sequência de tripeptídeo His-Tyr-Gly que forma um cromóforo verde que pode ser fotoconvertido em vermelho por uma eliminação de β catalisada por luz e subsequente extensão de um sistema conjugado com π³. Os PCFPs e suas variantes monoméricas são ferramentas úteis para rastrear células^6-10 e estudar a dinâmica^{de proteínas 11-14}, respectivamente. Nos últimos anos, os PCFPs foram expressos em diferentes modelos animais, como peixe-zebra⁶, frango^7,8 e camundongo^9,10 para rastreamento do destino celular. Aqui, relatamos um protocolo para fotoconversão específica de células de PCFPs no embrião vivo de peixe-zebra e rastreamento adicional de proteínas fotoconvertidas em estágios posteriores de desenvolvimento. Esta metodologia permite estudar, de forma específica do tecido, os eventos biológicos celulares subjacentes à morfogénese no modelo animal de peixe-zebra.

Protocolo

1. Obtenção de embriões para o ensaio de fotoconversão

Após o cruzamento de peixes-zebra transgênicos expressando um PCFP, os embriões homozigotos mais brilhantes são escolhidos e cultivados a 28,5 °C até o estágio embrionário desejado¹⁵.

Nota 1: Esta pré-seleção permitirá escanear embriões com baixa potência de laser, evitando assim a fototoxicidade e o fotobranqueamento.

Nota 2: Sugerimos usar luz de baixa intensidade na visualização de embriões e mantê-los no escuro devido à alta sensibilidade dos PCFPs, como Kaede e KikGR, à exposição à luz, incluindo a luz do dia.

2. Incorporação

1. Em um recipiente de vidro com água de ovo, descorione os embriões sob estereomicroscópio usando fórceps.
2. Anestesiar os embriões transferindo um embrião descorionado para uma solução de tricaína (3-aminobenzoico acidetiléster de 3-aminobenzóico, Sigma-Aldrich) 0,16 mg / ml (40 μl de 4 mg / ml de solução estoque em 1 ml de meio E3 1X).

Nota 1: Transfira os embriões com uma pipeta de vidro ou uma ponta cortada (P1000) para minimizar o risco de danificar os embriões.

Nota 2: Embriões jovens descorionados não devem ser expostos ao ar ou levantados até a interface água/ar, pois os ovos se rompem facilmente quando submetidos a estresse mecânico.

3. Transfira o embrião anestesiado para a tampa de uma placa de cultura e mantenha o embrião dentro do menor volume possível de meio.
4. Transfira o embrião para agarose pipetando-o com agarose a 1% de baixa temperatura de fusão (LMA, Lonza) a 30 ° C contendo 0,16 mg / ml de tricaína e coloque-o na lamínula de uma placa de cultura com fundo de lamínula (MatTek Corp. Ashland MA EUA). Em seguida, oriente o embrião com a ajuda de uma ponta de plástico lisa (por exemplo, uma ponta de pipeta Microloader cortada, Eppendorf) e, quando a ML estiver polimerizada, cubra a agarose com 0,16 mg / ml de solução de tricaína.

Nota 1: Derreta 1% LMA a 60 °C e mantenha a agarose derretida a 30 °C.

3. Fotoconversão

1. Em um microscópio confocal invertido equipado com uma fonte de laser de 405 nm, 488 nm e 561 nm, como o Zeiss LSM 710, visualize a amostra por uma varredura z-Stack cobrindo toda a estrutura da amostra a ser fotoconvertida e rastreada posteriormente usando o laser de 488 nm (ou seja, laser Ar de 30 mW, a 5-7% de intensidade, detector ajustado para 493-540 nm) e o laser de 561 nm (ou seja,, laser DPSS 561 de 10 mW, com intensidade de 7-9%, detector ajustado para 587-651) para escanear o tecido/órgão quanto à fluorescência verde e vermelha das proteínas fotoconversíveis, respectivamente.

Observação 1: Para a varredura antes da fotoconversão, usamos uma objetiva Plan Apochromat 20x/NA 0,8.

Nota 2: Sempre procure a fluorescência vermelha antes do experimento para excluir que qualquer PCFP convertido em vermelho gerado acidentalmente esteja presente.

2. Selecione a ferramenta Série temporal e defina para 2 ciclos sem intervalo (um para pré e outro para pós-fotoconversão).
3. Selecione a ferramenta Regiões e defina uma ou mais regiões de interesse (ROI) para fotoconversão.

Nota 1: Recomendamos primeiro determinar a precisão com que a região realmente fotoconvertida pelo laser de varredura na ROI corresponde à ROI selecionada no software, medindo a área de tecido/células fotoconvertidas em todos os três (direção xy e z) em uma amostra fixa onde nenhum movimento celular ou proteico é esperado. Para as configurações descritas neste aplicativo, o ROI correspondeu à região fotoconvertida com grande precisão, mas isso depende da objetiva usada e da quantidade de laser aplicada para fotoconversão. O tamanho do ROI pode ser reduzido ao tamanho de uma única célula, dependendo da abertura numérica da objetiva, do fator de zoom e da quantidade de luz laser usada para fotoconversão.

4. Selecione a ferramenta Branqueamento e defina para iniciar o branqueamento após a digitalização 1 de 2. Usamos um laser de diodo de 30 mW e 405 nm para fotoconversão e cuidadosamente otimizado para a quantidade mínima de luz laser necessária para a fotoconversão completa, que é alcançada principalmente variando a intensidade da luz do laser, as iterações de varredura do ROI e o tempo de pixel (ou seja, velocidade de varredura).

Nota 1: Para fotoconversão usamos uma objetiva Plan Apochromat 20x/NA 0,8.

Nota 2: A potência do laser e o número de iterações devem ser determinados empiricamente para cada configuração experimental e devem garantir a fotoconversão completa de PCFP verde para vermelho dentro do ROI com a quantidade mínima necessária de luz laser para reduzir a fototoxicidade. Recomendamos iniciar testes usando baixa potência do laser (por exemplo, 3%, correspondendo a 0,03 mW no plano objetivo) combinado com baixo número de iterações (por exemplo, 20) e, posteriormente, aumentar a potência do laser até que a fotoconversão completa seja alcançada, o que em nossas mãos estava em 10% da potência do laser (correspondente a 0,1 mW no plano objetivo). Nessas condições, todos os embriões testados sobreviveram ao plano de tratamento. No entanto, observamos que a membrana vitelina é sensível a pulsos de laser e pode ser facilmente danificada causando a morte do embrião. Por esse motivo, a letalidade do embrião após a fotoconversão pode ser causada se a posição do tecido-alvo estiver próxima ao corpo da gema.

1. Escaneie a amostra por um z-Stack usando lasers para 488 nm e 561 nm para visualizar qualquer fluorescência verde e vermelha fotoconvertida restante do PCFP.

Nota 1: Para a varredura após a fotoconversão, usamos um Plan Apochromat 20x/NA 0,8.

4. Remova o embrião da agarose

1. Descarte a solução e remova cuidadosamente o embrião da ML a 1% com a ajuda de uma agulha ou ponta de plástico lisa.
2. Manter o embrião em água com ovo no escuro a 28,5 °C até à fase de desenvolvimento desejada.

Nota 1: É importante que os embriões continuem seu desenvolvimento em água de ovo, particularmente durante os primeiros dias de desenvolvimento durante a extensão do corpo embrionário. De fato, alguns tecidos/órgãos embrionários mudam de posição durante o desenvolvimento e, portanto, requerem orientações específicas durante a incorporação, que dependem do tecido/órgão específico de interesse e do estágio de desenvolvimento desejado da análise.

5. Reincorporação

1. Proceda como no ponto 2.) deste protocolo.

6. Rastreamento de tecido fotoconvertido em estágios embrionários posteriores

1. Varredura da região de interesse (z-Stack) usando lasers para 488 nm e 561 nm para sinais fluorescentes verdes e vermelhos, respectivamente.

Observação 1: Para o escaneamento x horas pós-fotoconversão, utilizou-se um Plano Apocromático 20x/NA 0,8.

Nota 2: Como este protocolo não afeta o desenvolvimento normal do embrião, é possível observar o embrião fotoconvertido em estágios posteriores de desenvolvimento (para isso, proceda conforme descrito nos pontos 4 a 6).

7. Resultados representativos

Um exemplo de ensaio de fotoconversão é mostrado na Figura 1. Rastreamos as células endoteliais durante o desenvolvimento do peixe-zebra (para uma revisão da anatomia vascular do peixe-zebra em desenvolvimento, consulte¹⁶). Assim, usamos uma linha repórter Tg (kdrl: nlsKikGR) ^hsc7 de peixe-zebra expressando KikGR dentro dos núcleos endoteliais¹⁷. Embriões homozigotos e de expressão brilhante foram criados a 28,5 ° C até 48 horas após a fertilização (hpf). Após a descorionação, os embriões foram anestesiados e incluídos na ML posicionando o lado ântero-dorsal do embrião em direção à lamínula para melhor visualização dos vasos cefálicos. Usamos um microscópio confocal invertido (Zeiss LSM 710 Meta) equipado com lasers operando a 405 nm, 488 nm e 561 nm, e uma objetiva Plan Apochromat 20x/NA 0,8 para o ensaio de fotoconversão e posterior rastreamento da proteína fotoconvertida. Conforme mostrado na Figura 1A, antes da fotoconversão, o KikGR foi expresso no tecido endotelial e só foi detectável como fluorescência verde usando um laser de argônio de 488 nm. As varreduras de controle com um laser DPSS 561-10 de 561 nm para fluorescência vermelha não detectaram nenhum KikGR fotoconvertido antes da fotoconversão (Figura 1A). Posteriormente, a ROI foi completamente fotoconvertida usando um laser de diodo de 405 nm (a 10% de intensidade, 20 iterações) e os vasos principais foram escaneados novamente usando os lasers de 488 nm e 561 nm (Figura 1B). Conforme mostrado na Figura 1B, o KikGR verde mudou completamente para vermelho dentro do ROI. Após o ensaio de fotoconversão, o embrião foi removido da agarose e criado a 28,5 °C em água de ovo. Finalmente, o embrião foi observado novamente 24 horas após a fotoconversão, em torno de 72 hpf, para rastrear as células endoteliais fotoconvertidas em estágios posteriores (Figura 1C). Assim, o embrião foi embebido em ML e a amostra foi reescaneada usando os lasers de 488 nm e 561 nm. Conforme mostrado na Figura 1C, dentro do tecido endotelial decorrente da ROI fotoconvertida, foram observadas proteínas KikGR não convertidas e fotoconvertidas devido à estabilidade do KikGR fotoconvertido fluorescente vermelho e à ressíntese de um novo KikGR verde não fotoconvertido.

Figura 1. Fotoconversão de KikGR durante o desenvolvimento do peixe-zebra. (A, B) Uma região específica da vasculatura da cabeça endotelial foi fotoconvertida a 48 hpf em embriões transgênicos Tg (kdrl: nlsKikGR) ^hsc7 e (C) observada novamente 24 horas após a fotoconversão (cerca de 72 hpf). A fluorescência de KikGR (verde), KikGR fotoconvertido (vermelho) e canais mesclados são mostrados. Os círculos pontilhados mostram o ROI antes, depois e 24 horas após a fotoconversão. As imagens são vistas dorsais do embrião de peixe-zebra, anterior ao fundo. Barras de escala: 50 μm.

Proteína (sigla) Ex (nm) Em (nm) Ce QY Estrutura Quaternária brilho aplicação Ref Kaede_G 508 518 Edição 99 0,9 tetrâmero 259 Rastreamento de células ^2,6 Kaede_R 572 580 60 0,3 tetrâmero 59 KikGR_G 507 517 54 0,7 tetrâmero 112 Rastreamento de células ^3,6,8-10 KikGR_R 583 593 35 0,6 tetrâmero 68 mKikGR_G 505 515 49 0,7 monômero 101 Rastreamento dinâmico Imagens de super-resolução ¹³ mKikGR_R 580 591 28 0,6 monômero 53 EosFP_G 506 516 72 0,7 tetrâmero 150 Rastreamento de células ^5,20 EosFP_R 571 581 41 0,5 tetrâmero 67 tdEos_G 506 516 34 0,7 dímero em tandem 165 Imagens de superresolução ^12,14,21 tdEos_R 569 581 33 0,6 dímero em tandem 59 mEos2_G 506 519 56 0,7 monômero 140 Rastreamento dinâmico Imagens de super-resolução ^11,18 mEos2_R 573 584 46 0,7 monômero 90 Dendra2_G 490 507 45 0,5 monômero 67 Rastreamento dinâmico Imagens de super-resolução ^4,11 Dendra2_R 553 573 35 0,55 monômero 57

Tabela I. Propriedades das proteínas fluorescentes fotoconversíveis. Juntamente com o nome comum e/ou acrônimo para cada PCFPs, os comprimentos de onda de pico de excitação (Ex) e emissão (Em), coeficientes de extinção molar (EC, 10-3 M-1 cm-1), rendimento quântico (QY), estrutura quaternária fisiologicamente relevante, brilho relativo (como % de EGFP), aplicação e referências são mostrados na tabela. Tabela adaptada de Day e Davidson, 2010¹.

PCFP Linhagens transgênicas de peixe-zebra fonte Kaede Tg(elavl3:Kaede)^rw0130a Laboratório Okamoto Tg(EPV. TP1-Mmu.Hbb:Kaede)   Tg(ins:Kaede)   Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)   Tg(lhx5:Kaede)^b1204/+ ZIRC Tg(myl7:kaede)   Tg(olig2:Kaede)   Tg(UAS-E1b:Kaede)^s1999t ZIRC Tg(UAS:Kaede)^rk8 ZIRC Tg(vsx2:Kaede)^nns2 Laboratório Higashijima KikGR Tg(kdrl:nlsKikGR)   Tg(krt4:NTR-KikGR)   Tg(myl7:nlsKikGR)   Tg(sox10:KikGR)   Tg(UAS:KikGR)   EosFP Tg(sox10:EosFP)   Tg(sox10:nlsEosFP)   Dendra Tg(-8mpx:Dendra2)   Tg(UAS:Dendra-kras)  

Tabela II. Linhagens transgênicas de peixe-zebra expressando PCFPs. Dados obtidos no Banco de Dados de Organismos Modelo de Peixe-Zebra (ZFIN, http://zfin.org/). A disponibilidade de linhas no Centro Internacional de Recursos do Peixe-Zebra (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/) é indicada.

Discussão

Nos últimos anos, modelos animais transgênicos para a expressão de proteínas fotoconversíveis, como Kaede ou KikGR, foram gerados. Esses animais se desenvolvem normalmente, indicando que essas proteínas não têm efeitos tóxicos no desenvolvimento embrionário. O primeiro relato sobre um ensaio de fotoconversão para rastreamento de células em embriões de animais foi realizado por Hatta e colaboradores por injeção de mRNA ou DNA que codifica Kaede em embriões de peixe-zebra de uma célula para expressão ubíqua, ou pela expres...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais:
Equipamento necessário para criar peixes e coletar ovos (consulte o Livro do Peixe-Zebra22 para obter detalhes).
Estereomicroscópio	Leica	Lecia MZ6 Estereomicroscópio	Equipado com laser operando a 488 nm
Microscópio confocal de varredura a laser	Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO	equipado com lasers operando a 488 nm, 561 nm e 405 nm
Bloco
de aquecimento Par de pinças
Prato de cultura com fundo de vidro	MatTek Corp		Pontas
Pipeta Microloader	Eppendorf
Vortex
needles
Reagents:
Egg water medium
60 μ g / ml Sais marinhos oceânicos instantâneos em ddH < sub > 2 < / sub> O
4 mg/ml Solução-mãe de tricaína
400 mg Tricaína (3-aminoácido benzóico etiléster)	Sigma-Aldrich
97,9 ml ddH2O
2,1 ml 1M Tris (pH9)
Ajustar a pH 7, alíquota e armazenar -20 &graus; C
1% LMA (agarose de baixa temperatura de fusão, Lonza)
1g LMA/100 ml E3 meio 1X
Alíquota e armazene a 4 ° O