Aqui, apresentamos um método para a comutação fotoativada de proteínas fluorescentes fotoconvertíveis (PCFPs) em embriões vivos de peixe-zebra e o rastreamento posterior da proteína fotoconvertida em pontos temporais específicos durante o desenvolvimento. Esta metodologia permite o monitoramento de eventos de biologia celular subjacentes a diferentes processos de desenvolvimento em um organismo vertebrado vivo.
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Artigo de método
Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
A embriogênese é um processo dinâmico que é melhor estudado por meio de técnicas que permitem a documentação de mudanças no desenvolvimento in vivo. O uso de proteínas fluorescentes codificadas geneticamente tem se mostrado uma estratégia valiosa para elucidar processos morfogenéticos dinâmicos conforme ocorrem no organismo intacto. Na última década, o desenvolvimento de proteínas fluorescentes fotoativáveis e fotoconvertíveis abriu a possibilidade de investigar o destino de subpopulações discretas de proteínas marcadas1. Diferentemente das proteínas fotoativáveis, as proteínas fluorescentes fotoconvertíveis (PCFPs) podem ser facilmente rastreadas e imagiadas em seu estado de emissão nativo antes da fotoconversão, facilitando a identificação e seleção de regiões por inspeção óptica. As PCFPs, como Kaede2, KikGR3, Dendra4 e EosFP5, podem mudar de verde para vermelho após exposição à luz UV ou azul, devido a uma sequência tríplice His-Tyr-Gly que forma um cromóforo verde, o qual pode ser fotoconvertido em um vermelho por meio de uma β-eliminação catalisada por luz e subsequente extensão de um sistema π-conjugado3. As PCFPs e suas variantes monoméricas são ferramentas úteis para rastrear células6-10 e estudar a dinâmica de proteínas11-14, respectivamente. Nos últimos anos, as PCFPs têm sido expressas em diferentes modelos animais, como peixe-zebra6, galinha7,8 e camundongo9,10, para o rastreamento do destino celular. Aqui relatamos um protocolo para fotoconversão específica de células com PCFPs no embrião vivo de peixe-zebra e posterior rastreamento das proteínas fotoconvertidas em estágios mais avançados do desenvolvimento. Essa metodologia permite estudar, de maneira específica a tecidos, eventos de biologia celular subjacentes à morfogênese no modelo animal peixe-zebra.
Protocolo
1. Obtenção de Embriões para o Ensaio de Fotoconversão
Após o cruzamento intra-linhas de peixes-zebra transgênicos que expressam um PCFP, os embriões homozigotos mais brilhantes são selecionados e criados a 28,5 °C até o estágio embrionário desejado15.
Observação 1: Esta pré-seleção permitirá a varredura de embriões com baixa potência de laser, evitando assim fototoxicidade e fotobranqueamento.
Observação 2: Sugerimos utilizar luz de baixa intensidade ao visualizar embriões e mantê-los em condições de escuridão devido à alta sensibilidade das PCFPs, como Kaede e KikGR, à exposição à luz, incluindo luz solar.
2. Inclusão
- Em um recipiente de vidro com água para ovos, descorionate os embriões sob microscópio estereoscópico utilizando pinça.
- Anestesie os embriões transferindo um embrião descornionado para uma solução de Tricaina 0,16 mg/ml (éster etílico do ácido 3-amino benzóico, Sigma-Aldrich) (40μl de uma solução estoque de 4 mg/ml em 1 ml de meio E3 1X).
Observação 1: Transfira os embriões com uma pipeta de vidro ou uma ponteira cortada (P1000) para minimizar o risco de danificar os embriões.
Observação 2: Embriões jovens descorionados não devem ser expostos ao ar nem levantados até a interface água/ar, já que os ovos se rompem facilmente quando submetidos a estresse mecânico.
- Transfira o embrião anestesiado para a tampa de uma placa de cultura e mantenha o embrião no menor volume possível de meio.
- Transfira o embrião para o agarose pipetando o embrião com agarose a 1% de baixa temperatura de fusão (LMA, Lonza) a 30 °C contendo 0,16 mg/ml de Tricaine, e coloque-o sobre a lamínula de uma placa de cultura com fundo de lamínula (MatTek Corp. Ashland MA USA). Em seguida, oriente o embrião com a ajuda de uma ponteira plástica lisa (por exemplo, uma ponteira de Microloader cortada, Eppendorf) e, quando o LMA tiver polimerizado, cubra o agarose com solução de Tricaine a 0,16 mg/ml.
Observação 1: Derreta 1% de LMA a 60 °C e mantenha a agarose derretida a 30 °C.
3. Fotoconversão
- Em um microscópio confocal invertido equipado com fontes a laser de 405 nm, 488 nm e 561 nm, como o Zeiss LSM 710, visualize a amostra por meio de um scan em z-Stack que cubra toda a estrutura do espécime a ser fotoconvertido e rastreado posteriormente, utilizando o laser de 488 nm (ou seja, laser Ar de 30 mW, com intensidade de 5-7 %, detector ajustado em 493-540 nm) e o laser de 561 nm (ou seja, laser DPSS 561 de 10 mW, com intensidade de 7-9 %, detector ajustado em 587-651 nm) para escanear o tecido/órgão em busca da fluorescência verde e vermelha das proteínas fotoconvertíveis, respectivamente.
Observação 1: Para a varredura antes da fotocovversão, utilizamos uma objetiva Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
Observação 2: Sempre realize uma varredura para a fluorescência vermelha antes do experimento para excluir a presença de PCFP vermelho convertido acidentalmente.
- Selecione a ferramenta Time series e configure para 2 ciclos sem intervalo (um para antes e um para depois da fotoconversão).
- Selecione a ferramenta Regions e defina uma ou mais regiões de interesse (ROI) para fotoconversão.
Observação 1: Recomendamos determinar primeiro a precisão com que a região efetivamente fotoconvertida pelo laser de varredura na ROI corresponde à ROI selecionada no software, medindo a área do tecido/células fotoconvertidos nas três direções (xy e z) em um espécime fixado, onde não se espera movimento celular ou proteico. Para as configurações descritas nesta aplicação, a ROI correspondeu à região fotoconvertida com grande precisão, mas isso depende do objetivo utilizado e da quantidade de laser aplicada para a fotoconversão. O tamanho da ROI pode ser reduzido ao tamanho de uma única célula, dependendo da abertura numérica do objetivo, do fator de zoom e da quantidade de luz laser utilizada para fotoconversão.
- Selecione a ferramenta Bleaching e configure para iniciar o clareamento após a varredura 1 de 2. Utilizamos um laser de diodo de 405 nm com potência de 30 mW para a fotoconversão e otimizamos cuidadosamente a quantidade mínima de luz laser necessária para uma fotoconversão completa, o que é conseguido principalmente por meio da variação da intensidade da luz do laser, do número de varreduras da região de interesse (ROI) e do tempo por pixel (ou seja, velocidade de varredura).
Observação 1: Para a fotoconversão, utilizamos uma objetiva Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
Observação 2: A potência do laser e o número de iterações devem ser determinados empiricamente para cada configuração experimental e devem garantir a fotoconversão completa do PCFP verde para vermelho dentro da região de interesse (ROI), com a menor quantidade necessária de luz laser para reduzir a fototoxicidade. Recomendamos iniciar os testes com baixa potência do laser (por exemplo, 3%, correspondente a 0,03 mW no plano do objetivo) combinada com um baixo número de iterações (por exemplo, 20), aumentando posteriormente a potência do laser até que a fotoconversão completa seja alcançada, o que, em nossos experimentos, ocorreu com 10% de potência do laser (correspondente a 0,1 mW no plano do objetivo). Nessas condições, todos os embriões testados sobreviveram ao plano de tratamento. No entanto, observamos que a membrana do vitelo é sensível aos pulsos de laser e pode ser facilmente danificada, causando a morte do embrião. Por essa razão, a letalidade embrionária após a fotoconversão pode ocorrer se a posição do tecido-alvo estiver próxima ao corpo do vitelo.
- Analise a amostra por meio de um z-Stack utilizando lasers de 488 nm e 561 nm para visualizar a fluorescência verde remanescente e a fluorescência vermelha fotoconvertida do PCFP.
Observação 1: Para a varredura após a fotoconversão, utilizamos um Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
4. Remover o embrião do agarose
- Descarte a solução e remova cuidadosamente o embrião do LMA 1% com a ajuda de uma agulha ou de uma ponta plástica lisa.
- Mantenha o embrião em água de ovo no escuro a 28,5 °C até o estágio de desenvolvimento desejado.
Observação 1: É importante que os embriões continuem seu desenvolvimento em água de ovo, particularmente durante os primeiros dias de desenvolvimento, quando ocorre a extensão do corpo embrionário. De fato, alguns tecidos/órgãos embrionários mudam de posição durante o desenvolvimento e, portanto, exigem orientações específicas durante a inclusão, o que depende do tecido/órgão de interesse e do estágio de desenvolvimento desejado para análise.
5. Reembebição
- Prossiga como no ponto 2.) deste protocolo.
6. Rastreamento do Tecido Fotoconvertido em Estágios Embriónicos Posteriores
- Escaneamento da região de interesse (z-Stack) utilizando lasers para 488 nm e 561 nm para os sinais fluorescentes verde e vermelho, respectivamente.
Observação 1: Para a varredura x horas após a fotoconversão, utilizamos um Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
Observação 2: Como este protocolo não afeta o desenvolvimento normal do embrião, é possível observar o embrião fotoconvertido em estágios posteriores do desenvolvimento (para isso, proceda conforme descrito nos pontos 4 - 6).
7. Resultados Representativos
Um exemplo de ensaio de fotoconversão é mostrado na Figura 1. Rastreamos células endoteliais durante o desenvolvimento de peixe-zebra (para uma revisão da anatomia vascular do peixe-zebra em desenvolvimento, veja16). Assim, utilizamos uma linhagem repórter de peixe-zebra Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 que expressa KikGR dentro dos núcleos endoteliais17. Embriões homozigotos e com expressão intensa foram criados a 28,5 °C até 48 horas após a fertilização (hpf). Após a descorionação, os embriões foram anestesiados e embutidos em LMA, posicionando o lado anterior-dorsal do embrião em direção ao coverslip para melhor visualização dos vasos da cabeça. Utilizamos um microscópio confocal invertido (Zeiss LSM 710 Meta) equipado com lasers operando em 405 nm, 488 nm e 561 nm, e uma objetiva Plan Apochromat 20x/NA 0,8 para o ensaio de fotoconversão e posterior rastreamento da proteína fotoconvertida. Como mostrado na Figura 1A, antes da fotoconversão, o KikGR era expresso dentro do tecido endotelial e era detectável apenas como fluorescência verde utilizando um laser de Argônio de 488 nm. Varreduras de controle com um laser DPSS 561-10 de 561 nm para fluorescência vermelha não detectaram qualquer KikGR fotoconvertido antes da fotoconversão (Figura 1A). Posteriormente, a região de interesse (ROI) foi completamente fotoconvertida utilizando um laser de Diodo de 405 nm (com intensidade de 10%, 20 iterações) e os vasos da cabeça foram escaneados novamente utilizando os lasers de 488 nm e 561 nm (Figura 1B). Como mostrado na Figura 1B, o KikGR verde havia mudado completamente para vermelho dentro da ROI. Após o ensaio de fotoconversão, o embrião foi removido do agarose e criado a 28,5 °C em água de ovo. Finalmente, o embrião foi observado novamente 24 horas após a fotoconversão, por volta de 72 hpf, para rastrear as células endoteliais fotoconvertidas em estágios posteriores (Figura 1C). Assim, o embrião foi embutido novamente em LMA, e a amostra foi reescaneada utilizando os lasers de 488 nm e 561 nm. Como mostrado na Figura 1C, dentro do tecido endotelial derivado da ROI fotoconvertida, foram observadas tanto proteínas KikGR não fotoconvertidas quanto fotoconvertidas, devido à estabilidade do KikGR fotoconvertido com fluorescência vermelha e à re-síntese de novo KikGR verde não fotoconvertido.
Figura 1. Fotoconversão da KikGR durante o desenvolvimento do peixe-zebra. (A,B) Uma região específica da vasculatura endotelial da cabeça foi fotoconvertida aos 48 hpf em embriões transgênicos Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 e (C) observada novamente 24 horas após a fotoconversão (aproximadamente 72 hpf). São mostradas a fluorescência da KikGR (verde), da KikGR fotoconvertida (vermelha) e os canais sobrepostos. Círculos tracejados indicam a região de interesse (ROI) antes, após e 24 horas após a fotoconversão. As imagens são vistas dorsais do embrião de peixe-zebra, com a extremidade anterior voltada para baixo. Barras de escala: 50 μm.
| Proteína (Acrônimo) | Ex (nm) | Em (nm) | EC | QY | Estrutura quaternária | Brilho | Aplicação | Ref |
| Kaede_G | 508 | 518 | 99 | 0.9 | tetramérico | 259 | Rastreamento celular | 2,6 |
| Kaede_R | 572 | 580 | 60 | 0.3 | tetramérico | 59 | ||
| KikGR_G | 507 | 517 | 54 | 0.7 | tetramérico | 112 | Rastreamento celular | 3,6,8-10 |
| KikGR_R | 583 | 593 | 35 | 0.6 | tetramérico | 68 | ||
| mKikGR_G | 505 | 515 | 49 | 0.7 | monomérico | 101 | Rastreamento dinâmico Imagens de super-resolução | 13 |
| mKikGR_R | 580 | 591 | 28 | 0.6 | monomérico | 53 | ||
| EosFP_G | 506 | 516 | 72 | 0.7 | tetramérico | 150 | Rastreamento celular | 5,20 |
| EosFP_R | 571 | 581 | 41 | 0.5 | tetramérico | 67 | ||
| tdEos_G | 506 | 516 | 34 | 0.7 | dímero em tandem | 165 | Imagens de super-resolução | 12,14,21 |
| tdEos_R | 569 | 581 | 33 | 0.6 | dímero em tandem | 59 | ||
| mEos2_G | 506 | 519 | 56 | 0.7 | monomérico | 140 | Rastreamento dinâmico Imagens de super-resolução | 11,18 |
| mEos2_R | 573 | 584 | 46 | 0.7 | monomérico | 90 | ||
| Dendra2_G | 490 | 507 | 45 | 0.5 | monomérico | 67 | Rastreamento dinâmico Imagens de super-resolução | 4,11 |
| Dendra2_R | 553 | 573 | 35 | 0.55 | monomérico | 57 |
Tabela I. Propriedades das proteínas fluorescentes fotoconvertíveis. Juntamente com o nome comum e/ou acrônimo de cada PCFP, são apresentados na tabela os comprimentos de onda de pico de excitação (Ex) e emissão (Em), coeficientes de extinção molar (EC, 10-3 M-1 cm-1), rendimento quântico (QY), estrutura quaternária fisiologicamente relevante, brilho relativo (como % do EGFP), aplicações e referências. Tabela adaptada de Day e Davidson, 20101.
| PCFP | Linhas transgênicas de peixe-zebra | Fonte |
| Kaede | Tg(elavl3:Kaede)rw0130a | Okamoto Lab |
| Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede) | ||
| Tg(ins:Kaede) | ||
| Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) | ||
| Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ | ZIRC | |
| Tg(myl7:kaede) | ||
| Tg(olig2:Kaede) | ||
| Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t | ZIRC | |
| Tg(UAS:Kaede)rk8 | ZIRC | |
| Tg(vsx2:Kaede)nns2 | Higashijima Lab | |
| KikGR | Tg(kdrl:nlsKikGR) | |
| Tg(krt4:NTR-KikGR) | ||
| Tg(myl7:nlsKikGR) | ||
| Tg(sox10:KikGR) | ||
| Tg(UAS:KikGR) | ||
| EosFP | Tg(sox10:EosFP) | |
| Tg(sox10:nlsEosFP) | ||
| Dendra | Tg(-8mpx:Dendra2) | |
| Tg(UAS:Dendra-kras) |
Tabela II. Linhagens transgênicas de peixe-zebra expressando PCFPs. Dados obtidos no Banco de Dados do Organismo Modelo Peixe-Zebra (ZFIN, http://zfin.org/). A disponibilidade das linhagens no Centro Internacional de Recursos de Peixe-Zebra (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/) está indicada.
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Discussão
Nos últimos anos, foram gerados modelos animais transgênicos para a expressão de proteínas fotocovertíveis, como Kaede ou KikGR. Esses animais se desenvolvem normalmente, indicando que essas proteínas não possuem efeitos tóxicos sobre o desenvolvimento embrionário. O primeiro relato sobre um ensaio de fotconversão para rastreamento celular em embriões animais foi realizado por Hatta e colaboradores, mediante injeção de mRNA ou DNA codificando Kaede em embriões de peixe-zebra de um único blastômero para expressão ubíqua, ...
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Divulgações
Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Ian C. Scott por gentilmente fornecer a linhagem transgênica de peixe-zebra Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 no Hospital for Sick Children, Toronto, Canadá. Agradecemos à Instalação Central de Microscopia Confocal e de Dois Fótons (Centro Max-Delbrueck para Medicina Molecular) e ao Dr. Zoltan Cseresnyes pelo excelente suporte técnico e assistência geral em imageamento. S.A.-S. recebe apoio de uma bolsa Heisenberg da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Este trabalho foi apoiado pelo financiamento DFG SE2016/7-1.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais: | |||
| Equipamento necessário para criar peixes e coletar ovos (consulte o Zebrafish Book22 para obter detalhes). | |||
| Microsscópio estereoscópico | Leica | Leica MZ6 Microsscópio Estereoscópico | Equipado com laser operando em 488 nm |
| Microsscópio confocal de varredura a laser | Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | equipado com lasers operando em 488 nm, 561 nm e 405 nm |
| Bloco de aquecimento | |||
| Par de pinças Dumont #5 | |||
| Placa de cultura com fundo de lamínula | MatTek Corp | Ashland MA EUA | |
| Pontas de pipeta Microloader | Eppendorf | ||
| Vórtex | |||
| agulhas | |||
| Reagentes: | |||
| Meio de água para ovos | |||
| 60 μg/ml de Sais Marinhos Instant Ocean em ddH2O | |||
| Meio E3 | |||
| 5 mM NaCl | |||
| 0,17 mM KCl | |||
| 0,33 mM CaCl2 | |||
| 0,33 mM MgSO4 | |||
| 0,00001% (p/v) Azul de Metileno | |||
| Solução estoque de Tricaina 4 mg/ml | |||
| 400 mg de Tricaina (éster etílico do ácido 3-amino benzóico) | Sigma-Aldrich | ||
| 97,9 ml de ddH2O | |||
| 2,1 ml de Tris 1M (pH 9) | |||
| Ajustar para pH 7, fracionar e armazenar a -20 °C | |||
| 1% LMA (agarose de baixa temperatura de fusão, Lonza) | |||
| 1 g de LMA/100 ml de meio E3 1X | |||
| Fracionar e armazenar a 4 °C |
Referências
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
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- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
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Reimpressões e permissões
