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Artigo de método

Nanopartículas virais para

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⸱

DOI:

10.3791/4352

⸱

16 de novembro de 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Biomedical Engineering, Radiology, and Materials Science and Engineering, Case Western Reserve University

Neste artigo

Resumo

Nanopartículas de plantas virais (VNPs) são promissoras plataformas para aplicações em biomedicina. Aqui, descrevemos os procedimentos para a propagação de plantas VNP, purificação, caracterização e bioconjugação. Por fim, mostramos a aplicação de VNPs para homing tumor e de imagem usando um modelo de xenoenxerto mouse e imagens de fluorescência.

Resumo

O uso de nanomateriais tem o potencial de revolucionar a ciência de materiais e medicamentos. Actualmente, um número de diferentes nanopartículas estão a ser investigados para aplicações em imagiologia e terapia. Nanopartículas virais (VNPs) derivados de plantas pode ser considerada de auto-montagem bionanomaterials com tamanhos e formas definidas. Vírus de plantas em estudo em laboratório Steinmetz incluem partículas formadas por icosaédrica Cowpea mosaic virus (CPMV) e vírus do mosaico Brome (BMV), ambos os quais são de 30 nm de diâmetro. Também estamos a desenvolver estruturas em forma de bastonete e filamentosas derivados de vírus de plantas os seguintes: vírus do mosaico do tabaco (TMV), o qual forma hastes rígidas com as dimensões de 300 nm por 18 nm, e os vírus da batata X (PVX), que formam as partículas filamentosas 515 nm de comprimento e 13 nm de largura (o leitor é remetido para refs. 1 e 2 para mais informações sobre VNPs).

in planta, são excepcionalmente estáveis ​​e biocompatíveis. Além disso, VNPs são "unidades programáveis", que podem ser especificamente modificados usando a modificação genética ou métodos químicos bioconjugação 3. A estrutura de VNPs é conhecida a resolução atómica, e modificações podem ser efectuadas com uma precisão espacial ao nível atómico 4, um nível de controle que não pode ser conseguido usando os nanomateriais sintéticos com correntes estado-da-arte.

Neste artigo, descreve a propagação de CPMV, PVX, TMV e BMV em Vigna ungiuculata e plantas Nicotiana benthamiana. Extracção e purificação de protocolos para cada VNP são dadas. Métodos para caracterização da purificada e VNPs quimicamente marcados encontram-se descritos. Neste estudo, nos concentramos em chrotulagem emical de VNPs com fluoróforos (por exemplo, Alexa Fluor 647) e polietileno glicol (PEG). Os corantes de rastreamento e facilitar a detecção dos VNPs 5-10, e PEG reduz a imunogenicidade das nanopartículas proteicas enquanto melhora sua farmacocinética 8,11. Demonstramos tumor homing de VNPs peguilado utilizando um rato modelo de xenoenxerto de tumor. Uma combinação de imagens de fluorescência de tecidos ex vivo utilizando Maestro Imaging System, a quantificação da fluorescência em tecidos homogeneizados, e microscopia confocal é utilizada para estudar a biodistribuição. VNPs são limpas por meio do sistema reticuloendotelial (RES); tumor homing de forma passiva, através da maior permeabilidade e efeito de retenção (EPR) 12. A nanotecnologia VNP é um poderoso plug-and-play tecnologia para imagem e tratar locais de doença in vivo. Estamos aprofundar VNPs para transportar cargas de drogas e porções de imagem clinicamente relevantes, bem como tecido-específicos para ligandosalvo receptores moleculares overexpressed em câncer e doenças cardiovasculares.

Protocolo

1. VNP (CPMV, VMB, PVX, e TMV) Propagação

  1. Defina a câmara de plantas de interior controla a 15 horas do dia (100% de luz, 25 ° C, umidade 65%) e 9 horas da noite (luz 0%, 22 ° C, umidade 60%).
  2. Inocular plantas de acordo com a linha do tempo na Tabela 1.
CPMV PVX, TMV e BMV
Dia 0: Fábrica 3 caupi sementes / vaso. Dia 0: Planta ~ 30 sementes de N. benthamiana / vaso. Fertilizar uma vez por semana, com uma colher de sopa de adubo / 5 L de água.
Dia 14: Re-pote N. benthamiana em uma planta / vaso.
Dia 10: Infect deixa folhas primárias com CPMV (5 μg/50 ul / folha) por inoculação mecânica com um pouquinho de carborundum. Dia 28: Infect três a five sai com PVX, TMV, ou BMV (5 μg/50 ul / folha) por inoculação mecânica com um pouquinho de carborundum.
Dia 20: Folhas de Colheita e armazenar a -80 ° C. Dia 42: Folhas de Colheita e armazenar a -80 ° C.

Timeline Tabela 1. Para crescer, infectando e corte de folhas.

Nota: A propagação CPMV só é demonstrada como um exemplo.

2. Purificação VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV)

Nota: Todos os passos são realizados em gelo ou a 4 ° C.

  1. Homogeneizar 100 g de folhas congeladas em um misturador padrão com 2 volumes de tampão frio (ver Tabela 2). Filtrar através de 2-3 camadas de gaze.
  2. Para PVX, ajustar o pH para 6,5 ​​utilizando HCl 1 M. Adicionar 0,2% (w / v) de ácido ascórbico e 0,2% (w / v) de sódio sulfite.
  3. Centrifugar homogenato bruto planta a 5.500 xg durante 20 min. Recolher o sobrenadante.
  4. Para BMV, camada de 25 ml de sobrenadante de mais de 5 ml de 10% (w / v) de uma solução de sacarose. Centrifugar a 9.000 xg durante 3 hr pelotas e ressuspender em 38,5% de solução de CsCl (w / v). Mix agitando durante 5 horas, em seguida, continuar com o passo 2.12.
  5. Extrair o material vegetal por adição de 0,7 volumes de 1:1 (v / v) de clorofórmio :1-butanol. Agita-se mistura durante 30-60 min.
  6. Centrifugar solução a 5500 xg durante 20 min. Recolher a fase aquosa superior.
  7. Adicionar NaCl a 0,2 M e 8% (w / v) de PEG (PM 8000). Para TMV, também adicionar 1% (v / v) de Triton X-100. Agita-se durante pelo menos 1 h, em seguida, deixar sentar durante pelo menos 1 hr.
  8. Centrifugar solução a 15.000 xg durante 15 min. Ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão. Para PVX, adicionar 0,1% de β-mercaptoetanol e de ureia a 0,5 M.
  9. Centrifugar a 8.000 xg durante 30 minutos e recolher o sobrenadante.
  10. Ultracentrífuga sobrenadante a 160000 xg durante 3 hr. Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão overnight.
  11. Preparar um gradiente de sacarose de 10-40% o uso de volumes iguais de 10%, 20%, 30% e 40% de sacarose em tampão (mais pesado primeiro). Permitir que o gradiente se equilibre durante a noite à temperatura ambiente.
  12. Ultracentrífuga sedimento ressuspenso sobre gradiente de sacarose a 100.000 xg durante 2 horas (24 horas para BMV).
  13. Colete banda de espalhamento de luz e dializar contra tampão.
  14. Caracterizar os VNPs (abaixo) e armazenar a 4 ° C. Para armazenamento de longo prazo, armazenar a -80 ° C.
CPMV e TMV 0,1 M de tampão fosfato de potássio (pH 7,0)
38,5 mM KH 2 PO 4
61,5 mM de K 2 HPO 4
PVX 0,5 M de tampão de borato (pH 7,8)
0,5 M de ácido bórico
Ajustar o pH com NaOH
BMV SAMA tampão (pH 4,5)
250 mM de acetato de sódio
10 mM de MgCl2
2 mM β-mercaptoetanol (adicionar fresco)

Tabela 2. Buffers e suas receitas para cada VNP.

Nota: A propagação CPMV só é demonstrada como um exemplo.

3. Caracterização VNP (CPMV, VMB, PVX, e TMV)

  1. Realizar a espectroscopia UV / visível para determinação da concentração de VNPs.
    1. Medir a absorvância de 2 ul de amostra, utilizando um espectrofotómetro NanoDrop.
    2. Determinar a concentração de partículas e corantes utilizando a lei de Beer-Lambert (A εcl =, em que A é a absorvância, ε é o coeficiente de extinção, c é a concentração, e L é o comprimento do caminho). O comprimento do percurso é de 0,1 cm para o NanoDrop.
      Os coeficientes de extinção VNP-específicos são os seguintes:
      CPMV: 8.1 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
      PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
      TMV: 3.0 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
      BMV: 5,15 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
  2. Analisar partículas por exclusão de tamanho de cromatografia líquida rápida de proteína (FPLC).
    1. Usando uma coluna de Superose 6 de exclusão de tamanho e o Explorador Akta, ug de carga 50-100 VNPs em 200 ul de 0,1 M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0).
    2. Definir detectores de 260 nm (ácido nucleico), 280 nm (proteína) e o comprimento de onda de excitação de quaisquer corantes ligados.
    3. Correr a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min durante 72 min.
    4. O perfil de eluição e A260: A280 nm indica se a preparação VNP é pura e se as partículas estão intactos e montados.
      O A260 seguinte: 280 rácios indicam uma preparação pura VNP:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
  3. Executar desnaturação (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris de poliacrilamida de electroforese em gel de gradiente 4-12% para analisar a pureza da preparação e conjugação de proteínas de revestimento individuais.
    1. Adicionar 3 ml de tampão de amostra LDS 4x a 10 ug das partículas em 9 ul de tampão de fosfato de potássio. Adicionar um adicional de 1 ul de tampão de amostra LDS 4x e 3 ul de β-mercaptoetanol a BMV a reduzir o elevado número de ligações dissulfureto.
    2. Incubar em bloco de aquecimento durante 5 minutos a 100 ° C.
    3. Coloque as amostras num gel de SDS.
    4. Executar amostras a 200 V durante 1 hora em MOPS 1x tampão de corrida.
    5. Documentar o gel com luz UV para visualizar proteínas de revestimento fluorescente.
    6. Para não fluorescente proteína, cora com azul de Coomassie (0,25% (w / v) de Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v / v) de metanol, 10% (v / v) de ácido acético) durante 1 h.
    7. Destain com 30% de metanol, 10% de ácido acético durante a noite. Change a solução, se necessário.
    8. Documentar o gel sob luz branca.
  4. Analisar a integridade das partículas por microscopia electrónica de transmissão (TEM).
    1. Diluir as amostras de 0,1-1 mg / ml em 20 ul de água desionizada.
    2. Colocar 20 gotas uL das amostras de Parafilm.
    3. Cobrir gotas com uma grelha TEM e deixe descansar por 2 min. Wick fora o excesso de solução da grelha com papel de filtro.
    4. Lavar grade, colocando sobre uma gota de água desionizada seguida wicking seco.
    5. Stain grade, colocando uma gota de 20 ul de 2% (w / v) de acetato de uranilo, durante 2 min. Wick fora o excesso de corante com papel de filtro.
    6. Lavar grelha mais uma vez em água.
    7. Observe grade sob um microscópio eletrônico de transmissão.

4. Conjugação química de VNPs com PEG e fluoróforos, purificação e caracterização

  1. Para os cálculos para as reacções abaixo, a massa molar dos VNPs são:
    CPMV: 5,6x 10 6 g / mol
    PVX: 35 x 10 6 g / mol
    TMV: 41 x 10 6 g / mol
    BMV: 4,6 x 10 6 g / mol
  2. Conjugado corantes e PEG a lisinas de superfície de CPMV PVX e utilizando um passo de N-hidroxi-succinimida da reacção de acoplamento: Adicionar 2,500 equivalentes molares (de todos os excessos molares referem-se a um excesso molar por VNP) de éster de succinimidilo Alexa Fluor 647 e 4.500 equivalentes de NHS- PEG (PM 5000), dissolvido em DMSO para CPMV em 0,1 M de tampão de fosfato de potássio. Quando se trabalha com PVX, adicionar um excesso molar de 10.000 NHS-corante e NHS-PEG. Ajustar os volumes de tampão e DMSO de tal forma que a concentração final de CPMV e PVX é de 2 mg / ml e de teor de DMSO é de 10% do volume total de reacção. Incubar a mistura de reacção durante a noite à temperatura ambiente, protegida da luz. CPMV e PVX tem 300 e 1.270 Usinas endereçáveis, respectivamente. (O leitor é remetido para as seguintes referências para ler mais sobremodificação química de CPMV e PVX: 13-15).
  3. Corantes e conjugados de PEG a tirosinas de TMV por acoplamento de diazônio seguido de cobre (I) catalisados ​​cicloadição azida-alcino.
    1. Preparar o sal de diazónio (alcino) através da mistura de 400 ul de 0,3 M de ácido mono-hidratado p-toluenossulfónico, em 25 ul de 3,0 M de nitrito de sódio, e 75 ul de 0,68 M destilado 3-etinilanilina dissolvidos em acetonitrilo a 4 ° C durante 1 h.
    2. Adicionar 3,3 ml de tampão de borato, pH 8,8, contendo 100 mM de NaCl e 1,25 ml de TMV (20 mg / ml de solução stock).
    3. Reagir o TMV com 450 ul da solução de sal de diazónio (alcino) num banho de gelo durante 3 h para adicionar uma ligadura para tratar alcino TMV pelo acoplamento de diazónio. A solução vai se transformar em uma cor marrom claro. TMV tem 2140 tirosinas disponíveis para conjugação.
    4. Purifica-se o produto final utilizando uma almofada de sacarose, tal como descrito no passo 4.4.
    5. Anexar-funcional azida Alexa Fluor 647 e PEG-azida (MW 5.000) using de cobre (I) catalisados ​​cicloadição azida-alcino (CuAAC). Adicionar 2 equivalentes de corante e azida de PEG-proteína de revestimento por e incubar com 1 mM de CuSO 4, 2 mM de AMG, e 2 mM de ascorbato de sódio à temperatura ambiente durante 15 min. Ajustar o volume do tampão de tal modo que a concentração final da reacção de TMV é de 2 mg / ml. (O leitor é remetido para as seguintes referências para ler mais sobre a modificação química do TMV: 16,17).
  4. Conjugado corantes para lisinas e PEG para cisteínas de cisteína BMV mutante (cBMV):
    1. Adicionar 2,000 equivalentes molares de Oregon Verde 488 éster de succinimidilo dissolvidos em DMSO a 0,1 M em cBMV TNKM tampão (50 mM de base Tris, 50 mM NaCl, 10 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, pH 7,4). Ajustar os volumes de tampão e DMSO de tal forma que a concentração final de BMV é de 1 mg / ml e de teor de DMSO é de 10% do volume total de reacção. Incubar a mistura de reacção durante a noite a 4 ° C protegidos da luz.
    2. Purificar partículas usando centrifugais filtros como descrito no passo 4.4.
    3. Adicionar 2,000 excesso molar de PEG-maleimida (MW 2000), utilizando as mesmas condições de reacção como antes, e incubar a mistura reaccional durante 2 horas a 4 ° C. cBMV tem 180 Usinas reativos e cisteína. (O leitor é remetido para as seguintes referências para ler mais sobre a modificação química da BMV: 18).
  5. Purificação: Filtrar a solução através de uma almofada de sacarose a 40% (w / v) a 160.000 xg durante 2,5 horas. Re-dissolver o sedimento em tampão. Alternativamente, dializar contra tampão apropriado usando 10 kDa filtros de corte de rotação.
  6. Caracterização: VNPs peguilado e marcado por fluorescência são analisadas utilizando os métodos acima descritos: UV / visível de espectroscopia, electroforese em gel SDS, FPLC, e TEM (não mostrado, no entanto, referem-se as Figuras 6 e 7).

5. Segmentação do tumor e imagem usando um modelo heteróloga Rato

  1. Cultura células HT-29 de cólon humano em meio RPMI suplementado com 5% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de L-glutamina, a 37 ° C em 5% de CO 2, utilizando 175 centímetros dois frascos de cultura de células.
  2. Lave as células duas vezes com PBS estéril e colheita por incubação com 5 ml de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 min. Inactivar a tripsina com 5 ml de meio RPMI. Recolher as células por centrifugação a 500 xg durante 5 min. a 4 ° C e ressuspender em meio RPMI fresco a 5x10 6 células/50 ul de meio (determinar contagem total de células utilizando azul de tripano e um hemocitómetro). Misturar-se com um volume igual de Matrigel antes da injecção (manter todas as soluções de reagentes e estéril).
  3. Adquirir seis semanas de idade NCR nu / nu e mantê-los em uma dieta de alfafa livre para 2 semanas. [Nota:. Todos os procedimentos com animais deve ser aprovada IACUC] Induzir xenoenxertos de tumor por injecção subcutânea de 5x10 6 células/100 ul / tumor nos flancos (2 tumores / ratinho), utilizando um medidor de 18 1/2 estérilagulha. Monitorar os animais regularmente. Medir o tamanho do tumor usando compassos de calibre e permitir que os tumores a crescer a um volume médio de 20 mm 3 (dentro dos próximos 12 dias). Atribuir ratos a dois diferentes grupos aleatoriamente: PBS e VNP (n = 3 ponto animais / grupo / hora). Utilizando uma seringa de insulina de 1 ml de calibre 28, por administrar a injecção intravenosa da veia da cauda 100 ul de PBS estéril, ou 10 mg / kg de formulação VNP.

Nota: experimentos de cultura de tecidos e estudos com animais vivos não será demonstrado. Demonstração prática será limitado ao processamento de tecido e aquisição de dados. Para uma referência no modelo de xenoenxerto de tumor HT-29, o leitor é remetido para ref 19.

Três técnicas são usadas para avaliar tumor homing de VNPs:

  1. Imagens de fluorescência utilizando Maestro Imaging System: ratinhos sacrifício em pontos de tempo diferentes (2, 24, e 72 horas), utilizando CO 2gás. Dissecar os animais e impostos especiais de consumo todos os principais órgãos (cérebro, coração, pulmões, baço, rins e fígado), juntamente com os tumores nos flancos, coloque os tecidos em parafilme, e analisar com o instrumento usando imagens de fluorescência de excitação amarelo e filtros de emissão (800 ms exposição) para detectar a presença de sinais de fluorescência nos tecidos (derivado de A647 etiqueta conjugados aos VNPs). Salve as imagens e analisar intensidades fluorescentes usando ImageJ 1.44o software ( http://imagej.nih.gov/ij ). Comparar o padrão de absorção das VNPs em tumores com outros tecidos importantes, com o tempo.
  2. Depois de imagem, corte cada tecido ao meio e incorporar um meia no composto outubro para análise crio-secção e confocal. Colete a outra metade em pré-pesados ​​crio-frascos e imediatamente congelá-los usando líquido N 2. Armazenar a -80 ° C até estar pronto para posterior processamento.
  3. Quantificação de fluorescência: Retecidos da medula pesos. Descongelar os tecidos congelados à temperatura ambiente e colocá-los em diferentes tubos de 50 ml Falcon contendo 1 ml de PBS. Usando um homogeneizador de tecidos de mão, homogeneizar o tecido para 2-3 min em PBS, em seguida, transferir o homogenado a tubos de microcentrífuga. Centrifugar os homogeneizados durante 10 min a 13000 xg para remover o não-tecido homogeneizado.
  4. Pipetar 100 uL do sobrenadante a partir de tecidos de cada grupo (PBS e VNP formulações / pontos de tempo) em uma placa de 384 poços UV preto. Avaliar a intensidade de fluorescência (Ex / Em comprimentos de onda 600/665), utilizando um leitor de placas. Normalizar os valores obtidos fluorescentes pelos pesos de tecido.
  5. Imunohistoquímica: Prepare crio-micrótomo seções (10 m) e armazenar a -20 ° C. Stain secções de tecido para os núcleos das células (DAPI) e marcador de células endoteliais (marcado com FITC anti-ratinho CD31). Realizar análise de microscopia confocal para mapear a localização vascular e intra-tumoral de VNP fluorescente marcados.

Nota: este procedimento não será demonstrada, os dados representativos são apresentados na Figura 8. Para uma referência em imuno-histoquímica e os métodos de coloração descrito, o leitor é remetido para ref 19.

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Resultados

Análise comparativa do crescimento de plantas; configuração experimental, estudo da variação da cor das folhas, método de clorose.
Figura 1. Plantas infectadas por vírus de plantas. Plantas de Vigna unguiculata infectadas com CPMV (A). Plantas de Nicotiana benthamiana infectadas com PVX (B), TMV (C) e BMV (D). As imagens foram obtidas cer...

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Discussão

Este protocolo proporciona uma abordagem para a modificação química da VNPs e suas aplicações para a imagiologia de tumores in vivo. As técnicas de imagem de animais de fluorescência, quantificação de fluorescência, e imunohistoquímica aqui apresentadas são úteis para o estudo de biodistribuição e avaliar tumor homing. Estas técnicas proporcionam informação valiosa sobre o acesso das nanopartículas para o tumor, através do efeito EPR. Ao combinar os resultados dos vários métodos de análise, obtemos uma...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIBIB bolsas R00 EB009105 (para NFS) e P30 EB011317 (para NFS), um NIH / NIBIB treinamento concessão T32 EB007509 (para AMW), um Case Western Reserve University Interdisciplinar Alliance Investment Grant (a NFS), E um caso Comprehensive Cancer Center concessão P30 CA043703 (para NFS). Agradecemos aos Steinmetz Lab pesquisadores estudantes de graduação para suas mãos no apoio: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Assim, e Paulo Chariou .

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produção de VNP
Câmara para plantas de interiorPercival ScientificE-41L2
V. unguiculata sementes (California black-eye no. 5)Burpee51771A
N. benthamiana sementesAs sementes de N. benthamiana foram um presente do Salk Institute. As sementes são produzidas por meio da propagação da planta.
CarborundumFisherC192-500
Solo para envasar Pro-mix BXPremier Horticulture713400
Fertilizante Jack's Professional 20-10-20 Peat-LiteJR Peters77860
Equipamento
50.2 rotor TiBeckman337901
Rotor SW 32 TiBeckman369694
Optima L-90K ultracentrífugaBeckman365672
rotor SLA-3000Thermo Scientific07149
rotor SS-34Thermo Scientific28020
Centrífuga Sorvall RC-6 PlusThermo Scientific46910
Frasco de polipropilenoBeckman355607Para rotor SLA-3000
Frasco de policarbonatoBeckman357002Para rotor SS-34
Tubo Ultra-ClearBeckman344058Para gradiente de sacarose e rotor SW 32 Ti
Garrafa de policarbonatoBeckman355618Para centrifugação e rotor 50.2 Ti
espectrofotômetro NanoDropThermo ScientificNanoDrop2000c
Sistema de géis pré-fabricados PowerEase 500InvitrogenEI8675EU
Coluna de exclusão por tamanho Superose 6 10/300 GL (24 ml)GE Healthcare17-5172-01
ÄCromatógrafo KTA Explorer 100GE Healthcare28-4062-66
Allegra X-12RBeckman392302Centrífuga de bancada
CriostatoLeicaCM1850
Maestro 2Caliper Life SciencesIn vivo sistema de imagem
Tissue-TearorBiospec Products985370-395
Leitor de microplacasTecanInfinite-200
Microscópio eletrônico de transmissãoZEISSLibra 200FE
microscópio confocal a varredura a laser FluoViewOlympusFV1000
Produtos químicos e reagentes
3-etinilanilinaSigma Aldrich498289-5G
placa preta de 384 poçosBD Biosciences353285
Gel SDS-PAGE NuPAGE Bis-Tris 4-12%InvitrogenNP0321BOX
tampão amostral LDS 4XInvitrogenNP0008
Ácido acéticoFisherA385-500
AcetonitrilaSigma Aldrich271004-1L
azida Alexa Fluor 647InvitrogenA10277
Ácido carboxílico Alexa Fluor 647, éster succinimidilInvitrogenA20006
Filtros Centrífugos Amicon Ultra-0,5 mlMilliporeUFC501096corte de 10 kDa
Aminoguanidina hidrocloretoAcros Organics36891-0250
Ácido bóricoFisherA74-500
Azul de Coomassie Brillante R-250FisherBP101-25
CsClAcros Organics42285-1000
DAPIMP Biomedicals157574
DimetilsulfóxidoFisherBP231-100
Papel de filtroFisher09-801KGrau P5
FITC anti-rato CD31BioLegend102406
Soro de cabraInvitrogen16210-064
KClFisherBP366-500
sal de sódio do ácido L-ascórbicoAcros Organics35268-0050
MetanolFisherA412P-4
MgCl2FisherBP214-500
Lâminas de microscópioFisher12-544-3
Lâmina de vidro de microscópioVWR48366-277
tampão MOPSInvitrogenNP0001
mPEG-malNanocsPG1-ML-2kPM 2000
mPEG-N3NanocsPG1-AZ-5kPM 5000
mPEG-NHSNanocsPG1-SC-5kPM 5000
NaClFisherBP358-212
Oregon Green 488 éster succinimidila *isômero 6*InvitrogenO-6149
ácido p-toluenossulfônico monoidratadoAcros Organics13902-0050
PermountFisherSP15-100
Fosfato de potássio dibásicoFisherBP363-1
Fosfato monobásico de potássioFisherBP362-1
acetato de sódioFisherBP333-500
Nitrito de sódioAcros Organics42435-0050
Sulfito de sódioAmresco0628-500G
SacaroseFisherS6-500
grade de METTed PellaFCF-400Cu
Tris baseFisherBP152-500
Triton X-100EMD ChemicalsTX1568-1
β-mercapto–etanolFisherO3446I-100
Cultura de Tecidos
soro bovino fetalInvitrogen12483-020
HemocitômetroFisher0267110
células HT-29ATCCHTB-38
L-glutaminaInvitrogen25030-080
PBSCellgro21-040-CV
Penicilina-estreptomicinaInvitrogen10378-016
RPMI-1640Invitrogen31800-089
Frascos de cultura de tecidosCorning431080175 cm2
Azul de TripanoThermo ScientificSV30084.01
Tripsina, 0,05% (1X) com EDTA 4Na, líquidoInvitrogen25300-054
Estudos com Animais
Dieta para Roedores com 18% de ProteínaHarlan TekladTeklad Global 2018SDieta livre de alfafa
Seringa de insulinaBD Biosciences32941028 gauge
IsofluranoBaxterAHN3637
Matriz de membrana basal MatrigelBD Biosciences356234
camundongos NCR nu/nuEscola CWRU
da Medicina, Instalação Central de Animais Atímicos e Xenografias
Seringa estérilBD Biosciences30519618 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT CompoundAndwin Scientific4583

Referências

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